機械刺激直接誘導心肌細胞血管緊張素Ⅱ-1型受體活化的機制.pdf

1、心肌細胞膜血管緊張素Ⅱ-1型(AT1)受體的過度活化是心肌肥厚發(fā)生、發(fā)展的重要原因。AT1受體敲除或活性受抑均可以有效的緩解壓力超負荷引起的心肌肥厚和損傷的進展。近年來研究表明,AT1受體不但可以被其配體血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)所激活,而且還可以直接被機械刺激所活化,繼而引起心肌肥厚。機械刺激直接激活AT1受體是一個全新的發(fā)現(xiàn),目前對其發(fā)生機制、調控因素以及引發(fā)心肌肥厚的主要細胞內(nèi)信號轉導途徑均不明確。本研究在內(nèi)源性AngⅡ缺失的細胞株

2、(COS7細胞和HEK293細胞)中分別轉染野生型AT1受體和鈣調蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)質粒,然后給予體外機械牽張,證實了CaMKⅡ對于機械牽張激活AT1受體具有重要作用。另外我們在不表達AngⅡ的血管緊張素原基因敲除(ATG-/-)小鼠中實施主動脈縮窄(trarlsverseaortaconstriction,TAC)手術構建了壓力超負荷心肌肥厚模型,并給予AT1受體阻斷劑Losartan和特異性CaMKⅡ抑制劑KN93干預。結果表

3、明持續(xù)2周的TAC在ATG-/-小鼠中引起了顯著的代償性心肌肥厚,Losartan和KN93在沒有明顯影響血流動力學的情況下均有效的緩解了心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展。在機械刺激誘導肥厚的心肌細胞中,CaMKⅡ向心肌細胞膜聚集定位并與AT1受體結合,Losartan可以抑制二者結合,而KN93對二者之間的結合無顯著抑制作用。在構建不同部位的CaMKⅡ突變體并將其和野生型AT1受體共轉染進COS7細胞之后,牽張并檢測肥厚反應,發(fā)現(xiàn)將CaMKⅡ中間自

4、我抑制結構敲除之后,對AT1受體的感受機械刺激能力的抑制最為顯著,因此推測CaMKⅡ與AT1受體蛋白的結合位點可能出于其中間結構域。鑒于鈣調神經(jīng)磷酸酶(CaN)在AT1受體介導的AngⅡ致心肌肥厚的細胞內(nèi)信號通路中的核心地位,我們推測CaN可能在AT1受體介導的細胞外機械信號的胞內(nèi)信號通路中也扮演者重要的角色。因此我們在壓力超負荷構建的的ATG-/-小鼠心肌肥厚模型中以Losartan和特異性的CaN抑制劑FK506干預,證實Losar

5、tan和FK506均有效抑制了壓力超負荷引起的心肌肥厚,抑制AT1受體活性也顯著性降低了心肌細胞內(nèi)的CaN表達,證實CaN是AT1受體介導的細胞外機械信號的不可或缺的胞內(nèi)信號蛋白。
　　綜合以上研究結果,我們認為機械刺激引起心肌細胞內(nèi)CaMKⅡ向膜聚集并與AT1受體結合和相互作用,使得AT1受體可以直接被機械刺激活化并介導心肌肥厚。某些AT1受體阻斷劑如Losartan可以抑制CaMKⅡ與AT1受體之間的結合,而CaMKⅡ與AT1

6、受體的結合部位可能位于其中間自我抑制結構。在AT1受體介導的心肌細胞外機械刺激的信號通路中,CaN是其中重要的信號分子。
　　第一部分，CaMKⅡ參與了機械刺激直接誘導的AT1受體激活
　　目的:驗證CaMKⅡ是否參與了機械刺激直接誘導的AT1受體活化過程。
　　方法:在硅膠皿培養(yǎng)的COS7細胞中單轉染或共轉染野生型CaMKⅡ與AT1受體質粒,機械牽張8分鐘后收集細胞總蛋白以免疫印跡法(Western-blot)檢測磷

7、酸化細胞外信號調節(jié)蛋白激酶(extracellularsignal-regulatedproteinkinases,p-ERKs)的表達水平,提取細胞總RNA,以逆轉錄PCR檢測胎兒型基因ANP、BNP和骨骼肌α-肌動蛋自(skeletal-αactin,SAA)基因表達水平。
　　結果:在沒有轉染AT1受體質粒的COS7細胞中,無論是AngⅡ還是牽張刺激,均不能引起p-ERKs和ANP、BNP以及SAA的表達上調。在單獨轉染AT

8、1受體但是沒有轉染CaMKⅡ質粒的COS7細胞中,機械牽張引起了p-ERKs和ANP表達的輕度上調。在共轉染CaMKⅡ與AT1受體質粒的COS7細胞中,牽張刺激引起了明顯的p-ERKs和ANP、BNP以及SAA的表達上調。
　　結論:AT1受體是介導機械刺激引起的增殖反應的最主要膜受體,CaMKⅡ參與了機械刺激活化AT1受體的過程。
　　第二部分，機械刺激誘導CaMKⅡ向心肌細胞膜聚集并與AT1受體結合
　　目的:研究

9、在機械刺激引起的心肌肥厚中,CaMKⅡ與心肌細胞膜AT1受體的關系。
　　方法:32只8-10周齡的血管緊張素原基因敲除(ATG-/-)小鼠被均分為4組:假手術+生理鹽水干預組,TAC+生理鹽水干預組,TAC+Losartan(3mg/Kg/d)干預組,TAC+KN93(3mg/Kg/d)干預組。生理鹽水和干預藥物溶液均通過術前3天埋植在小鼠背部皮下的滲透壓泵24小時持續(xù)給藥。TAC術后2周,所有小鼠在行經(jīng)胸心臟超聲測定心臟形態(tài)和

10、心功能,侵入性心導管檢測主動脈以及左室壓力后處死,取心臟測量心重并計算心重體重比值,部分心臟石蠟包埋后HE染色測定心肌細胞橫截面積,部分心臟做冰凍切片以備后期免疫熒光觀察,部分心臟液氮凍存或者直接用于抽提總蛋白、膜蛋白或者總RNA。Western-blot檢測抽提總蛋白中p-ERKs表達,檢測膜蛋白中CaMKⅡ和AT1受體蛋白表達。免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,Co-IP)檢測CaMKⅡ和AT1受體蛋白的結合

11、,用免疫熒光激光共聚焦成像方法觀察CaMKⅡ和AT1受體分布和共定位狀態(tài)。體外培養(yǎng)COS7細胞并轉染野生型CaMKⅡ和AT1受體質粒,牽張刺激24小時后,提取細胞膜蛋白行Western-blot檢測膜CaMKⅡ含量,Co-IP檢測CaMKⅡ和AT1受體的結合。
　　結果:TAC手術在ATG-/-小鼠中顯著升高了主動脈血壓和左心室收縮末期壓力,Losartan和KN93干預并沒有明顯影響TAC引起的血流動力學異常。2周的TAC在AT

12、G-/-小鼠中引起了代償性心肌肥厚,心超表現(xiàn)為左心室前壁和后壁增厚,左心室內(nèi)徑減小,反應性左心室射血分數(shù)增加而左室短軸縮短率無明顯變化。TAC后2周小鼠心重體重比和心肌細胞橫截面積均顯著增加,肥厚相關標志物包括p-ERKs和ANP、BNP和SAA表達均顯著升高,SERCA2表達下降。Losartan和KN93干預顯著抑制了左心室前、后壁增厚,左室內(nèi)徑的減小和左心室射血分數(shù)異常,對FS無明顯改變,同時也顯著降低了心重體重比、心肌細胞橫截面

13、積和肥厚相關標志物的表達異常。TAC引起心肌細胞膜CaMKⅡ表達明顯增加。Losartan顯著抑制了CaMKⅡ的在心肌細胞膜的表達上調,KN93對心肌細胞膜的CaMKⅡ聚集抑制作用更為明顯。心臟切片免疫熒光證實TAC之后CaMKⅡ在心肌細胞膜區(qū)域高濃度聚集,KN93比Losartan更為顯著的抑制這種趨勢。Co-IP和免疫熒光發(fā)現(xiàn),TAC引起了CaMKⅡ和AT1受體在心肌細胞膜結合,Losartan可以明顯抑制二者的結合,而KN93對二

14、者結合的抑制作用不明顯。在體外培養(yǎng)的COS7細胞轉染野生型CaMKⅡ和AT1質粒,牽張刺激24小時后的受體的膜蛋白檢測提示機械牽張促使CaMKⅡ向細胞膜聚集并和AT1受體結合。
　　結論:機械刺激引起心肌細胞內(nèi)CaMKⅡ向膜聚集并與AT1受體結合,可能是AT1受體直接被機械刺激活化的重要機制。雖然KN93更為明顯的抑制了CaMKⅡ向心肌細胞膜的聚集,但卻不能像Losartan那樣抑制CaMKⅡ與AT1受體之間的結合。
　　第

15、三部分，機械刺激后CaMKⅡ與AT1受體結合的部位
　　目的:研究在機械刺激下CaMKⅡ與AT1受體的可能結合部位。
　　方法:在硅膠皿培養(yǎng)的COS7細胞中單轉染或共轉染野生型AT1受體質粒與CaMKⅡ突變體質粒,牽張刺激8分鐘后收集細胞總蛋白以Westem-blot法檢測轉染目的基因的蛋白表達效率和p-ERKs的表達水平。
　　結果:Western-blot檢測提示轉染的目的基因AT1受體質粒與CaMKⅡ突變體質粒的

16、蛋白表達顯著,轉染效率可靠穩(wěn)定。牽張刺激之后,共轉染野生型AT1受體質粒與CaMKⅡ的野生型、N端敲除突變體、C端敲除突變體質粒的COS7細胞中p-ERKs表達均有顯著上調,而轉染M段敲除突變體的COS7細胞牽張后的p-ERKs表達變化并不明顯,提示N、C端敲除對CaMKⅡ的功能無顯著影響,而M段對其促進AT1受體結合的作用顯著。
　　結論:CaMKⅡ的中間自我抑制區(qū)域可能是其與AT1受體的結合部位。
　　第四部分，AT1受

17、體受機械刺激活化后引起心肌肥厚的細胞內(nèi)信號轉導途徑
　　目的:研究在AT1受體介導的細胞外機械刺激的心肌細胞內(nèi)信號通路中鈣調神經(jīng)磷酸酶(calcineurin,CaN)的作用。
　　方法:8-10周齡的ATG-/-小鼠行如下處理:假手術+生理鹽水干預(n=8),TAC+生理鹽水干預(n=8),TAC+Losartan(3mg/Kg/d,n=8)干預,TAC+FK506(1mg/Kg/d,n=8)干預。生理鹽水和干預藥物溶液均

18、通過術前3天埋植在小鼠背部皮下的滲透壓泵24小時持續(xù)給藥。TAC術后2周,所有小鼠在行經(jīng)胸心臟超聲測定心臟形態(tài)和心功能,侵入性心導管檢測主動脈以及左室壓力后處死,取心臟測量心重并計算心重體重比值,部分心臟石蠟包埋后HE染色測定心肌細胞橫截面積,部分心臟直接用于抽提總蛋白和總RNA。Western-blot法檢測心肌細胞CaN表達水平。Realtime-PCR檢測肥厚相關基因ANP、SAA表達。
　　結果:TAC手術在ATG-/-小

19、鼠中成功構建代償性心肌肥厚模型。FK506干預作用同Losartan干預作用相似,在并沒有明顯影響小鼠血流動力學的情況下,明顯抑制了左心室前、后壁增厚,左室內(nèi)徑的減小和左心室射血分數(shù)異常,對FS無明顯改變。同時也顯著降低了心重體重比、心肌細胞橫截面積和肥厚相關標志物的表達上調。Losartan干預也有效抑制了心肌細胞CaN的表達。
　　結論:AT1受體介導了壓力超負荷誘發(fā)的心肌肥厚,并上調了細胞內(nèi)CaN表達,后者是AT1受體介導的

20、細胞外機械信號在細胞內(nèi)的極為重要的信號轉導蛋白。
　　結論：
　　1、機械刺激直接活化AT1受體需要CaMKⅡ的參與。
　　2、機械刺激引起心肌細胞內(nèi)CaMKⅡ向膜聚集并與AT1受體結合和相互作用,使得AT1受體可以直接被機械刺激活化,介導心肌肥厚作用。
　　3、CaMKⅡ的中間自我抑制區(qū)域可能是其與AT1受體的結合部位。
　　4、Losartan可以抑制CaMKⅡ與AT1受體之間的結合。
　　5、鈣

21、調神經(jīng)磷酸酶是AT1受體介導的機械刺激信號在細胞內(nèi)的重要信號轉導蛋白。
　　創(chuàng)新點和研究意義
　　1、本課題是針對機械刺激可以不依賴于AngⅡ直接激活AT1受體從而誘發(fā)心肌肥厚、損傷這一全新發(fā)現(xiàn)所做的深入機制研究。
　　2、揭示了機械刺激誘導CaMKⅡ和AT1受體的相互作用是導致AT1受體活化的重要機制。
　　3、發(fā)現(xiàn)了CaMKⅡ在機械刺激下向細胞膜的遷移定位現(xiàn)象,證實其并非只是單純的執(zhí)行細胞內(nèi)信號分子作用。