Paxillin在HPS相關(guān)PASMCs異常增殖中的作用和機(jī)制研究.pdf

1、背景和目的:
　　肝肺綜合征(hepatopulmonary syndrome,HPS)主要發(fā)生在包括肝硬化在內(nèi)的終末期肝病患者中,其發(fā)生率超過15％,而死亡率逐年增加,因此對于HPS的研究逐漸成為一個熱點(diǎn)。肝源性細(xì)胞因子,導(dǎo)致肺內(nèi)微血管擴(kuò)張(intraplmonary vasodilatation,IPVD),最終導(dǎo)致PASMCs的異常增殖,進(jìn)一步加重肺血管重建(pulmonary vascular remodelling,PV

2、R)。因此,PASMCs的異常增殖是HPS相關(guān)PVR最主要的病理變化。我們前期的研究發(fā)現(xiàn),HPS大鼠血清及3%濃度氧氣等可以誘導(dǎo)PASMCs異常增殖;同時,PASMCs發(fā)生表型轉(zhuǎn)化及其骨架蛋白也發(fā)生表達(dá)變化。既往研究發(fā)現(xiàn),在一些疾病(如肺動脈高壓)的病理進(jìn)程中,PASMCs異常增殖的同時,伴隨著PASMCs的表型轉(zhuǎn)化和骨架重排;PASMCs的表型轉(zhuǎn)化及其骨架蛋白的表達(dá)變化是PASMCs發(fā)生異常增殖的上游途徑。尋找骨架蛋白變化和細(xì)胞增殖的

3、關(guān)系,有利于進(jìn)一步解釋HPS的分子機(jī)制。
　　樁蛋白(Paxillin)是一種磷酸化蛋白,既往研究發(fā)現(xiàn),其在多種細(xì)胞內(nèi)表達(dá),參與多種細(xì)胞的生物學(xué)功能調(diào)節(jié),在細(xì)胞骨架蛋白的表達(dá)與重排中起重要調(diào)控作用。既往研究發(fā)現(xiàn),膜聯(lián)蛋白A1(annexin A1,ANXA1)可能和Paxillin具有相互作用,其可能影響Paxillin的表達(dá),對Paxillin的研究是在前期研究上的深入,具有重要意義?；谏鲜鲆罁?jù),我們推測:在HPS相關(guān)的PAS

4、MCs異常增殖中,首先出現(xiàn)細(xì)胞骨架蛋白的表達(dá)變化和骨架重排以及細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化,進(jìn)而導(dǎo)致PASMCs的異常增殖;Paxillin可能在細(xì)胞骨架蛋白的表達(dá)調(diào)節(jié)中起重要作用,并最終影響PASMCs的增殖。本研究擬通過膽總管結(jié)扎(common bile duct ligation,CBDL)構(gòu)建HPS大鼠模型,原代培養(yǎng)PASMCs,利用CCK-8、3H-TdR、RT-PCR及Western-blot等方法檢測PASMCs的增殖情況和其中Paxil

5、lin及骨架蛋白的表達(dá)情況;通過siRNA干擾技術(shù)對Paxillin進(jìn)行干預(yù),探討其中的分子機(jī)制;最終揭示Paxillin在HPS相關(guān)PASMCs異常增殖中的分子機(jī)制,為HPS的預(yù)防和診治提供更好的措施。
　　方法:
　　實(shí)驗(yàn)分為兩部分:
　　(1)HPS大鼠血清培養(yǎng)的PASMCs中Paxillin及骨架蛋白表達(dá)的變化
　　1)構(gòu)建HPS大鼠模型及血清制備
　　2)大鼠PASMCs的分離、培養(yǎng)和鑒定

6、　　3)RT-PCR及Western-blot法檢測Paxillin的表達(dá)變化
　　4)Western-blot法檢測骨架蛋白(α-actin,α-tubulin,destrin)的表達(dá)變化
　　(2)下調(diào)Paxillin的表達(dá)對HPS大鼠血清培養(yǎng)的PASMCs中骨架蛋白表達(dá)及其增殖的影響
　　1)siRNA下調(diào)PASMCs中Paxillin的表達(dá)
　　2)下調(diào)Paxillin表達(dá)后對HPS血清培養(yǎng)的PASMCs

7、異常增殖及骨架蛋白表達(dá)的影響
　　結(jié)果:
　　(1)HPS大鼠血清可以誘導(dǎo)Paxillin的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào),這一上調(diào)呈時間相關(guān)性。
　　(2)HPS大鼠血清刺激下PASMCs中骨架蛋白(α-actin,destrin,α-tubulin)表達(dá)呈時間相關(guān)性下調(diào)。
　　(3)利用特異性的Paxillin siRNA可以有效抑制Paxillin的蛋白表達(dá)。
　　(4)抑制Paxillin的表達(dá)后,HP