miR-182在耳蝸前體細(xì)胞增殖和分化中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、成年哺乳動物毛細(xì)胞缺乏自發(fā)再生的能力,所以隨著時間推移,受年齡、疾病、外傷等因素的損傷,毛細(xì)胞數(shù)量會逐漸減少,當(dāng)減少到一定程度后,就會出現(xiàn)聽力下降,導(dǎo)致感音神經(jīng)性耳聾。近年來,利用干細(xì)胞(stem cells)進(jìn)行替代治療成為毛細(xì)胞再生的研究熱點。
　　耳蝸前體細(xì)胞(Cochlear progenitor cells,CPCs)是指胚胎和新生哺乳動物耳蝸中存在的具有干細(xì)胞特點的細(xì)胞,在體外具有自我更新能力,可傳代培養(yǎng),誘導(dǎo)分化后可

2、表達(dá)毛細(xì)胞或支持細(xì)胞特異性標(biāo)志物,其中毛細(xì)胞樣細(xì)胞具有毛細(xì)胞纖毛樣結(jié)構(gòu)。與神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)相比較,耳蝸前體細(xì)胞在毛細(xì)胞再生研究方面具有很大的優(yōu)勢:首先,耳蝸前體細(xì)胞更容易分化成為毛細(xì)胞樣細(xì)胞;其次,耳蝸前體細(xì)胞分化為毛細(xì)胞標(biāo)志物陽性的細(xì)胞比例更高,達(dá)10％以上。因此,耳蝸前體細(xì)胞是目前替代損傷耳蝸毛細(xì)胞的最佳候選細(xì)胞。
　　microRNA(miRNA)是一類非編碼小分子RNA,具有高度的保守性,廣泛存在于哺乳動物基因組中,

3、調(diào)控著超過半數(shù)脊椎動物mRNA的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)miRNA183家族(包括miR-182/96/183)在出生后小鼠的內(nèi)耳毛細(xì)胞中特異性表達(dá),并在毛細(xì)胞的分化過程中高表達(dá)。其中,miR-182在具有增殖能力的耳蝸前體細(xì)胞(CPCs)中水平較高,而在細(xì)胞分化的過程中miR-182表達(dá)逐漸下降,且miR-182的表達(dá)水平在未分化的NSCs中顯著低于CPCs。我們認(rèn)為miR-182可能同時參與耳蝸毛細(xì)胞的增殖及分化調(diào)控,具有促進(jìn)耳蝸毛細(xì)胞再生的

4、潛能。
　　實驗一:大鼠耳蝸前體細(xì)胞的分離培養(yǎng)、鑒定及體外誘導(dǎo)分化模型的建立
　　目的:成年哺乳動物耳蝸毛細(xì)胞一旦損傷后不能自發(fā)再生,這是導(dǎo)致感應(yīng)神經(jīng)性耳聾的主要原因。通過對耳蝸毛細(xì)胞分化、調(diào)控機(jī)制的研究,也許可以幫我們找到毛細(xì)胞再生的新途徑。目前還沒有建立起能穩(wěn)定傳代的毛細(xì)胞細(xì)胞系及前體細(xì)胞細(xì)胞系。我們建立了耳蝸前體細(xì)胞體外分離、培養(yǎng)的體系,并在體外成功誘導(dǎo)分化產(chǎn)生毛細(xì)胞樣細(xì)胞,為研究毛細(xì)胞再生提供了切實可行的細(xì)胞模型。<

5、br>　　方法:從新生大鼠耳蝸中分離培養(yǎng)耳蝸前體細(xì)胞,進(jìn)行原代培養(yǎng),并用血清誘導(dǎo)分化。BrdU、Nestin免疫熒光染色鑒定細(xì)胞自我增殖能力;myosinⅦa和phalloidin免疫熒光染色鑒定其分化為毛細(xì)胞的潛能。
　　結(jié)果:耳蝸前體細(xì)胞體外培養(yǎng),第二天即形成大量細(xì)胞球,懸浮生長。收集懸浮的細(xì)胞球行免疫熒光染色,細(xì)胞球內(nèi)大量細(xì)胞BrdU、Nestin陽性。體外誘導(dǎo)耳蝸前體細(xì)胞分化,分化細(xì)胞表達(dá)myosinⅦa、phalloid

6、in等毛細(xì)胞標(biāo)志物,在電鏡下可見細(xì)胞表面有纖毛樣結(jié)構(gòu)。
　　結(jié)論:本研究證實在新生大鼠耳蝸內(nèi)存在具有增殖、分化能力的耳蝸前體細(xì)胞,這種前體細(xì)胞可以體外培養(yǎng),并可誘導(dǎo)分化產(chǎn)生毛細(xì)胞樣細(xì)胞。提示我們所建立的這個細(xì)胞培養(yǎng)體系可以用來研究毛細(xì)胞的功能,也可以用來研究毛細(xì)胞的再生。
　　實驗二:miR-182在耳蝸前體細(xì)胞增殖中的作用及其可能機(jī)制
　　目的:黑任軼等[39]在實驗中觀察到miR-182在耳蝸前體細(xì)胞未分化階段出現(xiàn)

7、表達(dá)量的峰值,隨后其表達(dá)量隨著細(xì)胞的分化進(jìn)行而逐漸下降。為進(jìn)一步研究miR-182對前體細(xì)胞增殖期的作用及其機(jī)制,我們應(yīng)用過表達(dá)及基因沉默技術(shù),向前體細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染miR-182的模擬物(mimics)及inhibitor,觀察miR-182過表達(dá)及低表達(dá)后對耳蝸前體細(xì)胞增殖凋亡的影響,并檢測細(xì)胞中部分相關(guān)基因蛋白表達(dá)量的變化。
　　方法:從新生大鼠耳蝸中分離培養(yǎng)耳蝸前體細(xì)胞,進(jìn)行增殖培養(yǎng)。分別利用miR-182 mimics和inh

8、ibitor在新生大鼠耳蝸前體細(xì)胞中過表達(dá)和低表達(dá)miR-182,然后繼續(xù)增殖培養(yǎng)4天后,用流式細(xì)胞儀檢測各組耳蝸前體細(xì)胞的細(xì)胞周期及凋亡,用RT-PCR、Western-blot檢測部分基因及蛋白的變化。
　　結(jié)果:使用miR-182 mimics進(jìn)行過表達(dá)后,耳蝸前體細(xì)胞中P27kip1、FoxO1、FoxO3表達(dá)量增加,細(xì)胞增殖能力減弱。使用inhibitor進(jìn)行低表達(dá),結(jié)果相反。
　　結(jié)論:過表達(dá)miR-182可以抑

9、制耳蝸前體細(xì)胞增殖,P27kip1、FoxO1、FoxO3等可能是其間接靶基因。外源性miR-182 mimics可以抑制耳蝸前體細(xì)胞的增殖,在耳蝸前體細(xì)胞未分化階段miR-182出現(xiàn)表達(dá)量的峰值,其作用可能是為了限制耳蝸前體細(xì)胞的增殖能力,防止細(xì)胞的過度增加。
　　實驗三:miR-182在耳蝸前體細(xì)胞分化中的作用及其可能機(jī)制
　　目的:探討miR-182誘導(dǎo)耳蝸前體細(xì)胞向毛細(xì)胞分化的作用及機(jī)制。
　　方法:從新生大鼠

10、耳蝸中分離培養(yǎng)耳蝸前體細(xì)胞并用分組血清誘導(dǎo)分化,分別利用miR-182 mimics和inhibitor在新生大鼠耳蝸前體細(xì)胞中過表達(dá)和低表達(dá)miR-182,然后細(xì)胞誘導(dǎo)分化7天后,用流式細(xì)胞儀檢測分化細(xì)胞中 myosinⅦa陽性細(xì)胞比例,用Western-blot檢測相關(guān)分子Sox2、Hes1、p27kip1、math1的變化。
　　結(jié)果:使用miR-182 mimics進(jìn)行過表達(dá)后,耳蝸前體細(xì)胞分化為myosinⅦa陽性表達(dá)的

11、細(xì)胞比例高于對照組,使用miR-182 inhibitor進(jìn)行低表達(dá)后此比例低于對照組。Western-blot檢測顯示Sox2、Hes1、p27kip1在miR-182mimics組較對照組降低,miR-182 inhibitor組較對照組增加。math1在miRNA182 mimics組增高,在inhibitor組減少。
　　結(jié)論:過表達(dá)miRN182可以促進(jìn)耳蝸前體細(xì)胞向毛細(xì)胞方向分化,Sox2、Hes1可能是此過程中的靶基