c-Myc及CyclinA2基因誘導(dǎo)大鼠耳蝸前體細(xì)胞增殖的體外研究.pdf

1、在成年哺乳動(dòng)物耳蝸中，聽(tīng)覺(jué)毛細(xì)胞和神經(jīng)元損傷后不能再生，這成為感音神經(jīng)性聾難以治愈的主要原因。近年來(lái)，自新生鼠耳蝸分離出前體細(xì)胞，在體外可定向分化為表達(dá)毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)元表型的細(xì)胞。我們?cè)隗w外比較了P1、P7和P14的大鼠耳蝸前體細(xì)胞的數(shù)量、增殖能力及超微結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明出生后耳蝸前體細(xì)胞大部分處于細(xì)胞周期的靜止期，并逐步通過(guò)分化和凋亡徹底地退出了細(xì)胞周期，耳蝸前體細(xì)胞也并非真正意義上的干細(xì)胞，而是處于干細(xì)胞與成熟子代細(xì)胞之間的中間細(xì)胞或

2、是處于干細(xì)胞未端的細(xì)胞。通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)c-Myc可能參與調(diào)控耳蝸的發(fā)育以及前體細(xì)胞的增殖、分化。結(jié)合之前的工作基礎(chǔ)，我們利用腺病毒技術(shù)將c-Myc和cyclinA2共轉(zhuǎn)染至新生鼠耳蝸前體細(xì)胞，可使其增殖，并促進(jìn)前體細(xì)胞重新進(jìn)入細(xì)胞周期。初步研究其調(diào)控機(jī)制，表明為經(jīng)典的CKI-cyclin-CDK途徑。
　　實(shí)驗(yàn)一大鼠耳蝸前體細(xì)胞的分離、培養(yǎng)
　　目的：對(duì)新生大鼠耳蝸前體細(xì)胞進(jìn)行分離、培養(yǎng)。
　　方法：從P7大鼠耳蝸中分離

3、、培養(yǎng)前體細(xì)胞，用免疫細(xì)胞化學(xué)的方法對(duì)前體細(xì)胞進(jìn)行鑒定；血清誘導(dǎo)分化后鑒定分化潛能，進(jìn)一步了解其多向分化特性。
　　結(jié)果：原代培養(yǎng)的細(xì)胞，培養(yǎng)1天后即可見(jiàn)“細(xì)胞球”，隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，可見(jiàn)細(xì)胞球體積增大，所含細(xì)胞增多；培養(yǎng)5天后，少部分細(xì)胞球內(nèi)的細(xì)胞出現(xiàn)分化及貼壁現(xiàn)象。細(xì)胞球內(nèi)大部分細(xì)胞呈nestin、musashi1和BrdU陽(yáng)性，表明其具有自我更新及有絲分裂的能力。細(xì)胞球經(jīng)誘導(dǎo)分化14d后，對(duì)分化細(xì)胞行免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定，發(fā)現(xiàn)

4、分化細(xì)胞表達(dá)毛細(xì)胞標(biāo)志物myosinVIIA和phalloidin，表達(dá)成熟神經(jīng)元標(biāo)志物NeuN，表達(dá)不成熟神經(jīng)元標(biāo)志物Tuj1，表達(dá)星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP，表達(dá)少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物galactocerebroside，以及谷氨酸能神經(jīng)元標(biāo)志物GluR-1，證明其具有多向分化潛能。
　　結(jié)論：本部分實(shí)驗(yàn)為研究耳蝸前體細(xì)胞成年后“沉默”的機(jī)制奠定基礎(chǔ)，為研究通過(guò)基因治療的方法促進(jìn)前體細(xì)胞增殖提供了一種體外模型。
　　實(shí)驗(yàn)二不

5、同日齡大鼠耳蝸前體細(xì)胞增殖能力及超微結(jié)構(gòu)的比較
　　目的：耳蝸前體細(xì)胞在成年后沉默或消失的具體機(jī)制尚不清楚，為探討其原因，我們?cè)隗w外比較了P1、P7和P14的大鼠耳蝸前體細(xì)胞的數(shù)量、增殖能力及超微結(jié)構(gòu)，觀察耳蝸前體細(xì)胞的轉(zhuǎn)歸。
　　方法：對(duì)P1、P7和P14分離出的耳蝸前體細(xì)胞，經(jīng)體外培養(yǎng)7天后進(jìn)行計(jì)數(shù)，檢測(cè)其數(shù)量變化，并每隔5天傳代觀察傳代數(shù)；采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期，來(lái)評(píng)估不同日齡新生大鼠耳蝸前體細(xì)胞增殖能力的變化；

6、應(yīng)用透射電鏡觀察不同日齡新生大鼠耳蝸前體細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。
　　結(jié)果：出生1周后耳蝸前體細(xì)胞的數(shù)量急劇下降，出生2周后的耳蝸內(nèi)未能分離出前體細(xì)胞；P7前體細(xì)胞的傳代數(shù)較P1減少；P7較P1更多的前體細(xì)胞處于有絲分裂的靜止期，增殖指數(shù)下降；P7的前體細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)中有更多分化細(xì)胞的特點(diǎn)。
　　結(jié)論：耳蝸前體細(xì)胞出生后大部分處于細(xì)胞周期的靜止期，并逐步通過(guò)分化和凋亡徹底地退出了細(xì)胞周期，他們并非真正意義上的干細(xì)胞，而是處于干細(xì)胞與成

7、熟子代細(xì)胞之間的中間細(xì)胞或是處于干細(xì)胞未端的細(xì)胞。
　　實(shí)驗(yàn)三c-Myc在大鼠耳蝸組織發(fā)育和耳蝸前體細(xì)胞分化過(guò)程中的表達(dá)變化
　　目的：原癌基因c-Myc具有調(diào)控G0/G1轉(zhuǎn)換和去分化的雙重作用。目前對(duì)于c-Myc在內(nèi)耳中的功能尚未見(jiàn)報(bào)道。我們擬通過(guò)檢測(cè)c-Myc在大鼠耳蝸組織發(fā)育及前體細(xì)胞分化過(guò)程中的表達(dá)情況，探討其在哺乳動(dòng)物耳蝸發(fā)育中的作用。
　　方法：1、取E10、E15、P1、P7和P14的SD大鼠耳蝸組織，應(yīng)

8、用RT-PCR、Westernblot的方法檢測(cè)c-Myc在大鼠耳蝸組織發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)情況。2、取耳蝸前體細(xì)胞和分化7天后的分化細(xì)胞，用RT-PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)染色和Westernblot的方法檢測(cè)c-Myc在耳蝸前體細(xì)胞分化過(guò)程中的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：從胚胎至出生后的耳蝸發(fā)育過(guò)程中，c-Myc表達(dá)量呈現(xiàn)逐漸下降趨勢(shì)；在前體細(xì)胞的分化過(guò)程中c-Myc的表達(dá)量也呈現(xiàn)下降。
　　結(jié)論：c-Myc的表達(dá)量在大鼠耳蝸組織發(fā)育及

9、耳蝸前體細(xì)胞分化的過(guò)程中逐漸下降，這表明c-Myc可能參與調(diào)控大鼠耳蝸組織的發(fā)育及前體細(xì)胞的分化。
　　實(shí)驗(yàn)四Ad-c-Myc-EGFP和Ad-CyclinA2-EGFP的構(gòu)建和轉(zhuǎn)染耳蝸前體細(xì)胞的濃度確定
　　目的：構(gòu)建目的基因分別為c-Myc和CyclinA2的腺病毒載體，體外轉(zhuǎn)染大鼠耳蝸前體細(xì)胞，觀察轉(zhuǎn)染效率及細(xì)胞活性，確定適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)染濃度。
　　方法：1、構(gòu)建復(fù)制缺陷重組腺病毒：Ad-CyclinA2-EGFP、A

10、d-c-Myc-EGFP及Ad-EGFP；2、在不同效靶比濃度下（MOI=50、100、150、200、250），Ad-EGFP轉(zhuǎn)染耳蝸前體細(xì)胞，觀察不同濃度轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞形態(tài)變化，熒光顯微鏡觀察EGFP表達(dá)情況，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分率；3、應(yīng)用MTT觀察細(xì)胞活性確定增殖點(diǎn)；4、確定MOI值，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。
　　結(jié)果：毒種上清液經(jīng)PCR鑒定，能夠特異地?cái)U(kuò)增出預(yù)期大小的條帶，證明該重組腺病毒攜帶目的片段。在不同效靶比濃度下，E

11、GFP陽(yáng)性細(xì)胞百分率隨MOI值的升高而增大；當(dāng)MOI=50，100，150時(shí)重組腺病毒對(duì)細(xì)胞的毒性作用與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異；當(dāng)MOI值=200時(shí)，細(xì)胞狀態(tài)不佳，出現(xiàn)生長(zhǎng)抑制。根據(jù)光鏡下細(xì)胞形態(tài)學(xué)證據(jù)，確定本實(shí)驗(yàn)采用MOI值為150。經(jīng)MTT法測(cè)定，細(xì)胞生長(zhǎng)曲線呈S形，轉(zhuǎn)染后36小時(shí)做為增殖點(diǎn)，應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率為25.2％。
　　結(jié)論：復(fù)制缺陷型腺病毒可有效轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的耳蝸前體細(xì)胞，為進(jìn)一步研究c-Myc和Cycli

12、nA2基因?qū)Χ伹绑w細(xì)胞增殖能力的影響奠定了基礎(chǔ)。
　　實(shí)驗(yàn)五c-Myc、CyclinA2基因?qū)Χ伹绑w細(xì)胞增殖能力的影響
　　目的：耳蝸前體細(xì)胞在體外具有一定的增殖能力，可定向分化為表達(dá)毛細(xì)胞和神經(jīng)元表型的細(xì)胞，但耳蝸前體細(xì)胞增殖能力差，并處于細(xì)胞周期的“靜止”狀態(tài)。我們用編碼目的基因?yàn)閏-Myc和CyclinA2的腺病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染耳蝸前體細(xì)胞，促進(jìn)其增殖并重返細(xì)胞周期，從而為誘導(dǎo)耳蝸受損細(xì)胞再生提供新的思路和依據(jù)。

13、r>　　方法：分別設(shè)立Ad-CyclinA2-EGFP轉(zhuǎn)染組、Ad-c-Myc-EGFP轉(zhuǎn)染組、Ad-EGFP轉(zhuǎn)染組及Ad-CyclinA2-EGFP、Ad-c-Myc-EGFP共轉(zhuǎn)染組；用復(fù)制缺陷腺病毒轉(zhuǎn)染大鼠耳蝸前體細(xì)胞，MOI值為150，用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)c-Myc和CyclinA2基因?qū)Χ伹绑w細(xì)胞周期的影響；BrdU孵育觀察轉(zhuǎn)染后有絲分裂能力的變化；觀察各組傳代能力變化，采用方差分析對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。
　　結(jié)果：流式

14、結(jié)果表明Ad-CyclinA2-EGFP轉(zhuǎn)染組、Ad-c-Myc-EGFP轉(zhuǎn)染組、Ad-EGFP轉(zhuǎn)染組對(duì)耳蝸前體細(xì)胞周期無(wú)明顯影響；而Ad-CyclinA2-EGFP、Ad-c-Myc-EGFP共轉(zhuǎn)染組可使部分耳蝸前體細(xì)胞進(jìn)入G1/S期和G2/M期，共轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組G0/G1期細(xì)胞比例分別為62.03±2.02％、78.27±6.09％（P﹤0.05）；增殖指數(shù)分別為37.97±2.015、20.41±7.16（P﹤0.05）。共轉(zhuǎn)染組

15、中共表達(dá)綠色熒光（EGFP）、紅色熒光（BrdU陽(yáng)性）及藍(lán)色熒光（Hoechst）的細(xì)胞球數(shù)量增多，表明共轉(zhuǎn)染c-Myc、CyclinA2使更多的耳蝸前體細(xì)胞具有有絲分裂的能力；各組間傳代能力無(wú)明顯變化。
　　結(jié)論：c-Myc基因和CyclinA2基因單獨(dú)作用于耳蝸前體細(xì)胞，在體外對(duì)細(xì)胞增殖與細(xì)胞周期無(wú)明顯影響。而c-Myc和CyclinA2基因共同作用于耳蝸前體細(xì)胞，可促進(jìn)細(xì)胞增殖，使部分前體細(xì)胞重返細(xì)胞周期。
　　實(shí)驗(yàn)六

16、c-Myc與CyclinA2基因促進(jìn)耳蝸前體細(xì)胞增殖的作用機(jī)制
　　目的：研究c-Myc和CyclinA2基因共同轉(zhuǎn)染耳蝸前體細(xì)胞后，檢測(cè)目的基因表達(dá)情況以及促進(jìn)細(xì)胞增殖的機(jī)制。
　　方法：應(yīng)用real-timePCR和Westernblot的方法觀察轉(zhuǎn)染Ad-EGFP與共轉(zhuǎn)染Ad-CyclinA2-EGFP、Ad-c-Myc-EGFP時(shí)目的基因、PCNA、CDK2以及P27KIP1在細(xì)胞中的表達(dá)水平變化。
　　結(jié)果：

17、real-timePCR和Westernblot結(jié)果證實(shí)攜帶目的基因的腺病毒轉(zhuǎn)染耳蝸前體細(xì)胞后能有效表達(dá)出相應(yīng)的mRNA和蛋白；并可升高PCNA與CDK2的表達(dá)水平，降低P27KIP1的表達(dá)水平。
　　結(jié)論：復(fù)制缺陷型腺病毒可有效介導(dǎo)c-Myc和CyclinA2基因轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的耳蝸前體細(xì)胞，并通過(guò)上調(diào)細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)激酶CDK2，下調(diào)CDK抑制蛋白P27KIP1，進(jìn)而上調(diào)細(xì)胞DNA合成期標(biāo)志蛋白PCNA來(lái)實(shí)現(xiàn)耳蝸前體細(xì)胞增殖的作