EGF、MCP-1對(duì)梗阻性急性腎損傷修復(fù)機(jī)制研究.pdf

1、急性腎損傷（Acute Kidney Injury，AKI）是臨床各科室常見(jiàn)急、危、重癥,腎后性因素是導(dǎo)致AKI的一個(gè)重要的原因，主要是因?yàn)槟蚵饭Ｗ枰鹋拍蛘系K、梗阻上方壓力增高，導(dǎo)致尿液逆流入腎內(nèi)產(chǎn)生腎實(shí)質(zhì)損害和腎功能障礙并最終導(dǎo)致腎功能衰竭的一種常見(jiàn)疾病。腎后性 AKI發(fā)病機(jī)制目前未完全清楚，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為本病是以梗阻為始動(dòng)因素所誘導(dǎo)的多種血管活性物質(zhì)、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、化學(xué)趨化蛋白、反應(yīng)氧代謝產(chǎn)物參與腎間質(zhì)炎癥、腎小管凋亡和間質(zhì)

2、纖維化導(dǎo)致腎小管萎縮、間質(zhì)纖維化和腎單位的喪失。本實(shí)驗(yàn)以雙側(cè)輸尿管梗阻模擬腎后梗阻性急性腎損傷，輸尿管梗阻時(shí)，梗阻部位以上壓力增高，腎盂積水內(nèi)壓逐漸增高，壓力經(jīng)集合管傳至腎小管和腎小球，使腎小球?yàn)V過(guò)率減少，腎實(shí)質(zhì)逐漸萎縮變薄，導(dǎo)致急性腎損傷。因此，腎后性AKI治療應(yīng)盡早明確診斷，及時(shí)解除梗阻，恢復(fù)尿流，恢復(fù)腎功能。
　　腎功能修復(fù)階段中，各種相關(guān)的生長(zhǎng)因子和化學(xué)趨化蛋白參與修復(fù)過(guò)程。表皮生長(zhǎng)因子（Epidermal Growth

3、Factor，EGF）是一種多功能的細(xì)胞因子，主要由頜下腺、腮腺、胰腺、腎臟、十二指腸、前列腺和腦等部位合成，通過(guò)自分泌或旁分泌的方式分泌在大多數(shù)體液、分泌液及組織中。EGF配體與表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）結(jié)合后，介導(dǎo)細(xì)胞增殖、分化，細(xì)胞運(yùn)動(dòng)遷移、血管生成、抗凋亡等。研究顯示在多種原因誘導(dǎo)的急性腎損傷模型中，外源性EGF能夠抑制腎小管上皮細(xì)胞凋亡、介導(dǎo)近端小管上皮去分化

4、，促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞再生與修復(fù)，促進(jìn)腎功能的恢復(fù)。單核細(xì)胞趨化蛋白-1(Monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)是相對(duì)分子質(zhì)量為8-10kD，屬于趨化因子β亞家族，可由多種細(xì)胞產(chǎn)生，包括成骨細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、單核／巨噬細(xì)胞和某些腫瘤細(xì)胞，腎臟的固有細(xì)胞上也有MCP-1的表達(dá)。MCP-l與單核細(xì)胞趨化蛋白受體CCR2結(jié)合后經(jīng)G蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，通過(guò)磷脂酰肌醇途徑發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。MCP-1

5、的主要生物學(xué)效應(yīng)是：①對(duì)單核／巨噬細(xì)胞有較強(qiáng)的誘導(dǎo)和趨化作用；②趨化和激活嗜堿性粒細(xì)胞，使其釋放組胺參與免疫調(diào)節(jié)；③誘導(dǎo)單核細(xì)胞粘附并浸潤(rùn)動(dòng)脈壁，與動(dòng)脈粥樣硬化的形成關(guān)系密切；④參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、代謝和凋亡過(guò)程；⑤對(duì)T細(xì)胞具有趨化和激活的雙重作用。正常情況下，MCP-1表達(dá)水平較低或不表達(dá)，但當(dāng)受到缺血、缺氧等因素刺激時(shí)，其表達(dá)上調(diào)，并在白細(xì)胞向炎癥部位趨化和隨后的活化過(guò)程中起重要協(xié)同作用。
　　國(guó)內(nèi)外主要研究腎前性及腎性AKI的一

6、些修復(fù)機(jī)制，對(duì)腎后性AKI再通的修復(fù)作用研究較少，國(guó)內(nèi)外主要集中在再通后水鹽代謝方面的研究，國(guó)外有學(xué)者研究腎后性梗阻再通后生長(zhǎng)因子的表達(dá)情況，探討其修復(fù)機(jī)制，國(guó)內(nèi)這方面研究較少?；贓GF、MCP-1可作為AKI的早期生物學(xué)標(biāo)記物，本研究擬通過(guò)建立成年大鼠BUO模型，測(cè)試在梗阻解除后的不同時(shí)間點(diǎn)EGF和MCP-1的變化情況，評(píng)價(jià)EGF和MCP-1在梗阻及再通后腎臟的表達(dá)情況，探討其修復(fù)機(jī)制。以期找到BUO導(dǎo)致急性腎損傷的修復(fù)過(guò)程中的關(guān)鍵

7、環(huán)節(jié)，可能為將來(lái)腎后性急性腎損傷的治療提供新的策略參考。
　　研究目的:
　　通過(guò)免疫組化染色及病理圖像分析軟件觀察各組腎組織 EGF、MCP-1表達(dá)情況，探討EGF、MCP-1在雙側(cè)完全輸尿管梗阻再通后的修復(fù)機(jī)制。
　　材料及方法:
　　主要材料：6-8周齡SPF級(jí)雄性SD大鼠40只，200-250g，廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；Anti-EGF antibody（兔抗鼠多克隆抗體），BOSTER公司提供；An

8、ti-MCP-1 antibody（兔抗鼠多克隆抗體），BIOSS公司提供；GTVision TMⅢ抗鼠/兔通用型免疫組化檢測(cè)試劑盒，DakoCytomation公司提供。
　　方法：
　　1.分組：實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分成五組，每組8只大鼠：假手術(shù)組（A組）、BUO24h組（B組）、BUO24h再通1d組（C組）、BUO24h再通4d組（D組）、BUO24h再通7d組（E組）。
　　2.動(dòng)物模型建立：采用V管卡壓法輸尿管結(jié)扎

9、術(shù)，大鼠購(gòu)買后，SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室中安靜飼養(yǎng)七天預(yù)適應(yīng)后，五組的大鼠均用10％水合氯醛（0.3ml/100g）腹腔注射麻醉后，取仰臥位，腹正中線行2.5-3.5cm切口，打開(kāi)腹腔，經(jīng)腹暴露左側(cè)腎盂輸尿管連接部（PUJ），在PUJ下方1cm處游離一段長(zhǎng)約5mm的輸尿管段，將長(zhǎng)約1.8cm的硬膜外麻醉用塑料導(dǎo)管對(duì)折成V型（V管），輕輕套卡在左輸尿管上，用1號(hào)絲線結(jié)扎 V管兩末端令輸尿管官腔夾閉，注意線結(jié)與末端之間僅保留1-2mm的距離，按照同樣

10、方法結(jié)扎右側(cè)輸尿管，縫合肌肉和皮膚。模型組24h后，同前法麻醉后再次按原路徑打開(kāi)腹腔，暴露梗阻部位，可看到V管上段輸尿管擴(kuò)張，表明造模成功，剪斷結(jié)扎在V管上的絲線，輕輕取下V管，解除梗阻。假手術(shù)組大鼠僅游離出雙側(cè)輸尿管，不結(jié)扎雙側(cè)輸尿管，縫合切口。
　　3.數(shù)據(jù)收集:假手術(shù)組和各模型組分別在24小時(shí)梗阻再通0h、1d、4d、7d心臟穿刺取血后全部處死，留取左腎組織做石蠟切片。3000轉(zhuǎn)/分高速離心10分鐘后留取血清，保存于-20℃

11、冰箱，留測(cè)血清肌酐。左腎組織置于10%中性福爾馬林溶液中固定，石蠟包埋以做常規(guī)HE染色和EGF及MCP-1免疫組織化學(xué)染色。利用DS-Ri1光學(xué)顯微鏡采圖，每張切片取5個(gè)高倍鏡視野，每個(gè)視野>500個(gè)細(xì)胞，分別計(jì)算陽(yáng)性率，陽(yáng)性率=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%，取平均值，數(shù)據(jù)用mean±SD表示結(jié)果，比較各組大鼠腎組織損傷評(píng)分，EGF及MCP-1的表達(dá)差異。
　　4.統(tǒng)計(jì)方法：用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件分析，所有數(shù)值用均數(shù)±標(biāo)

12、準(zhǔn)差（(X)±S）表示，采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的方差分析，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.大鼠雙側(cè)輸尿管梗阻24h肌酐及尿素氮顯著升高，而隨著梗阻再通時(shí)間的延長(zhǎng)，其數(shù)值又逐漸下降，至再通7天時(shí)，尿素氮及肌酐值逐漸下降，約降至正常水平。
　　2.光鏡：假手術(shù)組腎組織無(wú)明顯改變；雙側(cè)輸尿管梗阻24h后各模型組發(fā)生急性腎損傷，表現(xiàn)為腎小管上皮細(xì)胞空泡樣變性，部分腫脹、壞死，小管腔明顯擴(kuò)張，腎小管損傷積分較

13、高，腔內(nèi)可見(jiàn)脫落細(xì)胞，腎組織間質(zhì)水腫及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，再通1天后腎臟得到部分恢復(fù)，至第7天腎臟組織表現(xiàn)為輕度損傷，顯示基本恢復(fù)正常，腎小管積分逐漸下降。
　　3.大鼠雙側(cè)輸尿管梗阻24h后，腎組織MCP-1免疫組化染色示：在正常對(duì)照組未見(jiàn)明顯表達(dá)，梗阻24h組視野可見(jiàn)大量陽(yáng)性表達(dá)的腎小管上皮細(xì)胞，隨著梗阻再通時(shí)間的延長(zhǎng)，有陽(yáng)性表達(dá)的腎小管上皮細(xì)胞逐漸下降，至再通第7天時(shí)僅有散在的陽(yáng)性表達(dá)的腎小管上皮細(xì)胞。
　　4.腎組織EGF

14、免疫組化染色結(jié)果示：在正常對(duì)照組中可見(jiàn)表達(dá)陽(yáng)性的髓袢升支厚段及遠(yuǎn)曲小管的上皮細(xì)胞，梗阻24h組可見(jiàn)少量弱陽(yáng)性的腎小管上皮細(xì)胞，與對(duì)照組相比明顯下降，梗阻再通1d時(shí)陽(yáng)性的腎小管上皮細(xì)胞較前增多，隨著再通時(shí)間的延長(zhǎng)，陽(yáng)性細(xì)胞逐漸增多，至第7天達(dá)最高。
　　結(jié)論:
　　1.雙側(cè)輸尿管夾閉法（V管夾壓法）成功制作了腎后性急性腎損傷動(dòng)物模型；V管夾壓再通模擬了臨床上手術(shù)解除梗阻；
　　2.梗阻再通后，EGF表達(dá)增加，提示可能參與