鉤藤堿抗苯丙胺依賴作用的實驗研究.pdf

1、背景：苯丙胺類中樞興奮劑流行性濫用造成了嚴(yán)重的社會危害，對其干預(yù)是防治藥物依賴的一個新課題。對苯丙胺依賴形成機制研究有待進一步深入。中藥鉤藤已在許多戒毒復(fù)方中使用，但其主要活性成分鉤藤堿對苯丙胺類依賴的影響及作用機制尚未明確。 目的：復(fù)制苯丙胺依賴大鼠模型，觀察鉤藤堿對苯丙胺依賴大鼠條件性位置偏愛效應(yīng)的影響，檢測大鼠腦內(nèi)伏核及杏仁核NMDA受體2B亞單位的表達(dá)及中樞氨基酸類、單胺類及內(nèi)啡肽類神經(jīng)遞質(zhì)含量的變化，探討苯丙胺依賴形成

2、的神經(jīng)機制及鉤藤堿抗苯丙胺依賴的作用機理。 設(shè)計：完全隨機對照實驗研究。 動物：實驗動物采用雄性SD大鼠，經(jīng)自然位置偏愛時間測定合格動物共96只，體重(200-260)g，由第一軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供。隨機分為空白對照組、苯丙胺模型組、陽性藥氯胺酮組、鉤藤堿系列劑量組及鉤藤堿+生理鹽水組。 方法：鉤藤堿對苯丙胺依賴大鼠條件性位置偏愛效應(yīng)的影響及大鼠腦內(nèi)伏核和杏仁核NMDA受體2B亞單位表達(dá)的實驗共分7個組：即(

3、1)空白對照組，(2)苯丙胺模型組，(3)氯胺酮(15mg/kg)+苯丙胺組，(4)鉤藤堿低劑量(10mg/kg)+苯丙胺組，(5)鉤藤堿中劑量(20mg/kg)+苯丙胺組，(6)鉤藤堿高劑量(60mg/kg)+苯丙胺組，(7)鉤藤堿(60mg/kg)+生理鹽水組，每組8只大鼠。經(jīng)基線測定合格后隨機分組。動物給藥方法如下：(2)-(6)組每天上午(8：00)給予苯丙胺(2mg/kg，sc)，連續(xù)給藥4d；(3)組從第3天起在給苯丙胺之前

4、15min，ip給予氯胺酮(15mg/kg)，連續(xù)3d；(4)-(6)組于第二天20：00(即給苯丙胺后12h)，分別按上述劑量ip給予鉤藤堿，連續(xù)3d；(1)組以同容量生理鹽水替代苯丙胺給藥，其他處理同(2)組；(7)組每天上午(8：00)ip給予鉤藤堿(60mg/kg)。各組大鼠下午(16：00)均給予生理鹽水(0.5ml，sc)一次，間隔8h。連續(xù)4d。各組動物第1天上午注射藥物后立即將其置于伴藥箱即白箱，下午注射生理鹽水后立即將

5、其置于偏愛側(cè)黑箱，搭配時間均為1h，共訓(xùn)練4d。在末次給予苯丙胺24h后進行位置偏愛檢測，記錄大鼠在白箱中停留的時間。位置偏愛測定結(jié)束后，用戊巴比妥鈉麻醉大鼠，用4％多聚甲醛灌注固定，取出腦組織，脫水、石蠟包埋。對照大鼠腦解剖圖譜，分別選取含伏核、杏仁核部位的切片。嚴(yán)格按照博士德即用型SABC免疫組化染色試劑盒說明書及博士德NMDA-2B原位雜交檢測試劑盒說明書操作，免疫組化和原位雜交每組均設(shè)陰性對照。封片后顯微鏡下觀察，選取含伏核及杏

6、仁核部位分別照相，并選取相同大小視野下進行陽性細(xì)胞計數(shù)。腦電超慢漲落分析儀檢測大鼠腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)方法為：復(fù)制苯丙胺依賴大鼠模型，共分5個組，其中鉤藤堿只設(shè)60mg/kg劑量組，給藥方法同前。進行位置偏愛測定后采用腦電超慢漲落分析儀，記錄大鼠處于安靜狀態(tài)下的腦電信號并進行腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)信息處理，每只大鼠檢測18min。所有實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS(10.0)統(tǒng)計軟件進行完全隨機設(shè)計資料的單因素方差分析和t檢驗。 主要觀察指標(biāo)：苯丙胺依賴

7、大鼠條件性位置偏愛測定實驗中記錄大鼠15min內(nèi)在白箱的停留時間。采用免疫組化和原位雜交技術(shù)檢測大鼠腦內(nèi)伏核及杏仁核NR2B陽性細(xì)胞形態(tài)、分布及其數(shù)密度以及NR2BmRNA的表達(dá)。使用腦電超慢漲落分析儀觀察大鼠全腦分維參數(shù)地形圖和腦內(nèi)氨基酸類、單胺類及內(nèi)啡肽類神經(jīng)遞質(zhì)含量的變化。 結(jié)果：連續(xù)給予苯丙胺(2mg/kg)4d，大鼠在伴藥箱的逗留時間與空白對照組比較明顯延長(P＜0.01)，表明大鼠產(chǎn)生顯著的條件性位置偏愛效應(yīng)，建立了

8、苯丙胺依賴動物模型。鉤藤堿中、高劑量組大鼠在伴藥箱的逗留時間與空白對照組比較均無明顯差異，低劑量組稍有延長(P＜0.05)，與模型組比較均明顯縮短(P＜0.01)，鉤藤堿各劑量組隨劑量的增加其作用相應(yīng)增強。鉤藤堿+生理鹽水組大鼠在伴藥箱的逗留時間與空白對照組比較無明顯差異，與模型組比較有明顯差異(P＜0.01)，即不形成條件性位置偏愛。免疫組化和原位雜交檢測結(jié)果表明，正常大鼠腦內(nèi)伏核及杏仁核NR2B、NR2BmRNA主要分布于胞膜及胞漿

9、，經(jīng)DAB顯色后呈棕黃色。苯丙胺模型組大鼠伏核及杏仁核NR2B、NR2BmRNA陽性細(xì)胞數(shù)密度與空白對照組、氯胺酮組、鉤藤堿低、中、高三個劑量組及鉤藤堿+生理鹽水組比較均明顯增加(P＜0.01)，且胞核亦有著色。氯胺酮組、鉤藤堿中、高劑量組及鉤藤堿+生理鹽水組大鼠腦內(nèi)伏核及杏仁核NR2B、NR2BmRNA陽性細(xì)胞數(shù)與空白對照組比較均無顯著性差異，鉤藤堿低劑量組陽性細(xì)胞數(shù)量較空白對照組增加(P＜0.01)。免疫組化伏核及杏仁核NR2B缺一

10、抗及二抗陰性對照均未見胞膜、胞漿著色，原位雜交NR2BmRNA缺寡核苷酸探針陰性對照和缺生物素化抗寡核苷酸探針陰性對照也均未見NR2BmRNA著色。用腦電超慢漲落分析儀檢測大鼠全腦分維參數(shù)地形圖時發(fā)現(xiàn)，空白對照組大鼠全腦分維參數(shù)地形圖表現(xiàn)為“腦功能平衡圖”，苯丙胺模型組大鼠則完全偏離“腦功能平衡圖”，氯胺酮組、鉤藤堿組及鉤藤堿+生理鹽水組大鼠則與空白對照組相似。苯丙胺模型組大鼠腦內(nèi)IAAs、ACh及內(nèi)啡肽含量與空白對照組、氯胺酮組、鉤藤

11、堿組及鉤藤堿+生理鹽水組比較均顯著降低(P＜0.01)，EAAs、DA及NE含量則顯著升高(P＜0.01)；氯胺酮組、鉤藤堿組及鉤藤堿+生理鹽水組大鼠腦內(nèi)IAAs、EAAs、ACh、DA、NE及內(nèi)啡肽含量與空白對照組比較均無顯著性差異。 各組大鼠腦內(nèi)5-HT含量相互比較均無顯著性差異。 結(jié)論：預(yù)先給予鉤藤堿能在一定程度上消除苯丙胺誘導(dǎo)的條件性位置偏愛效應(yīng)，氯胺酮也能基本消除苯丙胺引起的位置偏愛效應(yīng)，而鉤藤堿本身未顯示精神

12、依賴性潛力。苯丙胺能增加大鼠腦內(nèi)伏核及杏仁核NR2B表達(dá)，這可能與苯丙胺依賴大鼠條件性位置偏愛形成有內(nèi)在聯(lián)系。鉤藤堿中、高劑量及氯胺酮對苯丙胺誘導(dǎo)伏核及杏仁核NR2B表達(dá)上調(diào)有抑制作用，鉤藤堿低劑量作用不明顯。鉤藤堿三個劑量及氯胺酮對伏核及杏仁核NR2B表達(dá)的抑制作用與對苯丙胺誘導(dǎo)大鼠位置偏愛效應(yīng)的抑制作用基本一致。鉤藤堿對正常大鼠腦內(nèi)NR2B表達(dá)無明顯影響與鉤藤堿不能誘導(dǎo)條件性位置偏愛形成相一致。苯丙胺依賴改變了正常大鼠腦功能的平衡狀