槐果堿抗實驗性小鼠肝癌作用及其機制研究.pdf

1、[研究背景及目的]:
　　 肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)已經(jīng)成為一個高度危險的疾病，其死亡率在全球癌癥中排第五位。目前，治療肝癌的有效方法，早期仍以傳統(tǒng)的手術(shù)治療為主，晚期多以放療、化療為主，但治療效果并不確切，由于大部分病人不能耐受化療過程的毒性反應(yīng)，不能支付起昂貴的醫(yī)藥費，因此肝癌的治療并未得到很大改善，故臨床上迫切需要尋求一種新的治療方法。
　　 腫瘤誘導(dǎo)分化治療是近年腫瘤臨

2、床治療方面的重要發(fā)現(xiàn)。所謂誘導(dǎo)分化是通過某些化學(xué)物質(zhì)使不成熟的惡性細(xì)胞逆轉(zhuǎn)，向正常細(xì)胞分化。腫瘤誘導(dǎo)分化的基本特點是不殺傷腫瘤細(xì)胞，而是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化為正常或接近正常的細(xì)胞，臨床上經(jīng)典的治療是維甲酸和砷劑誘導(dǎo)白血病細(xì)胞向正常成熟細(xì)胞發(fā)展，誘發(fā)白血病細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤增長。而目前的研究證實人參、丹參酮等多種中藥亦可使某些腫瘤細(xì)胞的一些惡性表型逆轉(zhuǎn)和再分化，使得分化治療惡性實體瘤也成為可能。
　　 槐果堿是從豆科槐屬植物苦參及豆科

3、槐屬植物苦豆子中的干燥根及其地面部分提取的有效單體，是一種藥源豐富，廉價、低毒且有效治療各種炎癥的藥物，臨床上槐果堿已用于治療病毒性心肌炎，惡性葡萄胎和子宮內(nèi)膜癌。但目前未見關(guān)于槐果堿治療肝細(xì)胞癌的報道。
　　 本課題旨在觀察槐果堿誘導(dǎo)分化治療肝癌的作用，并初步探討其可能的作用機制。
　　 [實驗方法]:
　　 一、槐果堿逆轉(zhuǎn)人肝腫瘤細(xì)胞株惡性表型
　　 1.槐果堿對肝腫瘤細(xì)胞株中肝細(xì)胞相關(guān)功能基因表達影

4、響
　　 將不同濃度的槐果堿（0，10，100μmol/L）處理24 h后的人肝癌細(xì)胞株MHCC-97H和HCC-LM3進行real-time PCR檢測細(xì)胞中一些肝細(xì)胞相關(guān)功能基因的表達情況。
　　 2.槐果堿對肝腫瘤細(xì)胞株中肝細(xì)胞相關(guān)功能基因表達的影響
　　 將不同濃度的槐果堿（0，10，100μmol/L）處理24 h后的MHCC-97H、HCC-LM3腫瘤細(xì)胞進行real-time PCR檢測腫瘤細(xì)胞株中

5、干細(xì)胞相關(guān)功能基因的表達情況。
　　 3.槐果堿對肝腫瘤細(xì)胞成球能力的影響
　　 將不同濃度的槐果堿（0，1μmol/L）分別處理24 h后的MHCC-97H的成球細(xì)胞進行real-time PCR檢測腫瘤細(xì)胞株中肝細(xì)胞和干細(xì)胞相關(guān)功能基因的表達情況。
　　 二、槐果堿對人肝癌細(xì)胞株生物學(xué)功能的影響
　　 1.槐果堿對肝腫瘤細(xì)胞增殖和克隆形成能力影響
　　 將人肝癌細(xì)胞株LM3和MHCC-97H以

6、5×103個/孔分入96孔板，分別用不同濃度的槐果堿（0，100，200，500，1000μmol/L）處理不同的人肝癌細(xì)胞株，從中篩選出兩株敏感細(xì)胞株，然后分別于24，48，72 h同一時間點檢測細(xì)胞活性并繪制生長曲線圖，并計算相關(guān)增殖抑制率。此外，將不同濃度的槐果堿(0，10，100，1000μmol/L)處理48 h后的肝腫瘤細(xì)胞LM3和MHCC-97H各取3×103個/皿接種于6 cm培養(yǎng)皿，連續(xù)培養(yǎng)2-3 w。期間不停添加新鮮

7、培液。同時將不同濃度槐果堿處理后的肝腫瘤細(xì)胞3×103個細(xì)胞接種于軟瓊脂糖膠上，連續(xù)培養(yǎng)2-3 w。
　　 2.槐果堿對肝腫瘤細(xì)胞侵襲能力和遷移能力的影響
　　 將Matrigel包被Chamber上層，然后將不同濃度的槐果堿(0，10，100μmol/L)處理48 h后的肝癌細(xì)胞LM3和MHCC-97H按每孔5×104細(xì)胞/200μl重懸于無血清的DMEM配液中，并接種到Chamber上層，下層24孔板中相應(yīng)的加入60

8、0μl含10％ FBS以及25μl的Fibronectin培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)48 h后，輕輕擦掉Chamber上層細(xì)胞，PBS稍微沖洗一下，然后0.5％結(jié)晶紫溶液染色，顯微鏡下觀察拍照。同樣我們將不同濃度的槐果堿（0，10，100μmol/L）分別處理24 h后MHCC-97H、HCC-LM3腫瘤細(xì)胞消化后利用Transwell進行的細(xì)胞遷移實驗，似上述侵襲能力檢測實驗，但不需Matrigel包被Chamber上層。
　　 三、槐

9、果堿誘導(dǎo)分化治療肝癌的機制
　　 1.槐果堿通過下調(diào)AKT/GSK-3β/β-catenin軸逆轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞株的惡性表型
　　 Ras/MAPK，PI3K/AKT和Wnt/βcatenin通路在腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展中起重要的作用。我們將不同濃度的槐果堿（0，100，200，500，1000μmol/L）處理人的肝癌細(xì)胞株LM3和MHCC-97H24 h后，用Westem Blot檢測上述通路相關(guān)蛋白的表達情況。結(jié)果顯示PI3

10、K/AKT通路的改變最為明顯。我們接著檢測下游AKT通路的下游蛋白p-GSK3β，GSK3β的變化，結(jié)果顯示p-GSK3β蛋白可被明顯抑制。研究發(fā)現(xiàn)AKT的磷酸化可明顯抑制GSK-3β，而GSK3β與多種基因密切相關(guān)，當(dāng)p-GSK3β活性被抑制后，GSK3β活性明顯增加，β-catenin活性將被抑制。Wnt/β-catenin是維持腫瘤干細(xì)胞自我更新最重要的通路，β-catenin是Wnt/β-catenin重要的基因，當(dāng)β-cate

11、nin活化后，腫瘤干細(xì)胞自我更新能力增強。我們前面的研究結(jié)果證實槐果堿能有效的抑制β-catenin的mRNA的表達。為進一步驗證GSK3β和ββ-catenin的關(guān)系，我們用PI3K的激活劑IGF激活p-GSK3β的活性后，Western Blot檢測p-GSK3β和相應(yīng)β-catenin的變化。同樣，我們用PI3K的抑制劑LY294002抑制p-GSK3β的活性后，Western Blot檢測p-GSK3β的改變和相應(yīng)β-caten

12、in的變化。
　　 2.槐果堿能下調(diào)TGF-β介導(dǎo)的EMT
　　 TGF-β在腫瘤細(xì)胞發(fā)生的EMT中起重要的作用，為進一步驗證槐果堿抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移是通過抑制TGFβ介導(dǎo)的EMT，我們將TGF-β與槐果堿共同處理24，48 h的人肝癌細(xì)胞株進行Real-time PCR和Western Blot檢測相關(guān)表皮及間皮相關(guān)指標(biāo)。
　　 四、槐果堿治療實驗性小鼠肝癌
　　 1.槐果堿瘤內(nèi)注射治療肝癌皮下種植瘤<

13、br>　　 將HCC-LM3以2×106/只注射至雄性nude小鼠腋下兩側(cè)，待腫瘤長出后的第6天，取左右腫瘤對稱的小鼠入組，分別瘤內(nèi)注射槐果堿和生理鹽水，隔天1次注射，共3w，觀察皮下腫瘤生長情況，腫瘤生長體積=1/2×長×寬2。
　　 2.槐果堿腹腔注射治療肝臟原位種植瘤
　　 將雄性4 w Balb/c Nude小鼠麻醉后，從腹部正中切口后使其充分暴露肝臟，將2×106/只的HCC-LM3細(xì)胞接種至肝包膜下，10d

14、后待腫瘤生長后，隨機將小鼠分成兩組，分別腹腔注射35 mg/kg的槐果堿和生理鹽水，每周5次，持續(xù)4w，4w后處死小鼠取出肝臟觀察腫瘤大小。
　　 五、統(tǒng)計學(xué)處理
　　 數(shù)據(jù)采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件包進行分析。方差齊性兩樣本資料采用兩樣本雙尾T檢驗;方差不齊的配對資料采用Wilcoxon符號秩檢驗;方差不齊的不配對資料采用Mann-Whitney U檢驗;P＜0.05為具有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 [實驗結(jié)果]:<

15、br>　　 一、槐果堿可誘導(dǎo)肝腫瘤細(xì)胞向肝細(xì)胞分化
　　 1.槐果堿下調(diào)肝腫瘤細(xì)胞株中CSCs比例
　　 我們發(fā)現(xiàn)小劑量的槐果堿（0，10，100μmol/L）可明顯抑制HCC-LM3和MHCC-97H細(xì)胞中CD133、CD90、Epcam、AFP mRNA的表達水平，此外，槐果堿可降低與維護干細(xì)胞增殖和自我更新相關(guān)基因的表達，包括括β-catenin，Oct3/4, NANOG, c-Myc等。
　　 2.槐

16、果堿可上調(diào)肝腫瘤細(xì)胞中部分肝功能相關(guān)基因表達
　　 將小劑量的槐果堿（0，10，100μmol/L）處理的人肝腫瘤細(xì)胞，利用real-timePCR檢測后發(fā)現(xiàn)，槐果堿可明顯上調(diào)部分肝功能基因表達，包括白蛋白(albumin，ALB)、葡萄糖-6-磷酸酶（glucose-6-phosphatase，G-6-P）、醛縮酶B(AldolaseB，ALDOB)、膽綠素還原酶(biliverdin reductase，BR)、細(xì)胞色素氧化

17、酶P4501A3(cytochrome P450 la3, CYPla3)等。
　　 二、槐果堿能抑制肝腫瘤細(xì)胞增殖及侵襲遷移能力
　　 1.槐果堿可抑制肝腫瘤細(xì)胞增殖及克隆形成
　　 我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)槐果堿濃度達到1000μmol/L，處理72 h的人肝癌細(xì)胞株HCC-LM3、MHCC-97H的生長抑制率分別約為67.1％±2.12％和52.98％±3.44％，且其生長抑制作用呈明顯劑量依賴性。我們還發(fā)現(xiàn)不同濃度的槐

18、果堿均可明顯抑制腫瘤細(xì)胞體外平板克隆及軟瓊脂克隆形成能力，且呈明顯的劑量依賴(p＜0.05，Student'stest)。同時我們用正常人肝細(xì)胞做對照時，發(fā)現(xiàn)高劑量的槐果堿（1000μmol/L）未抑制正常人肝細(xì)胞的增殖及克隆形成，所以我們認(rèn)為槐果堿對正常人肝細(xì)胞沒有毒性作用。流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示槐果堿能將人肝癌細(xì)胞株的細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，比例分別為20％±0.59％和19％±1.19％(p＜0.05，Student's test

19、)。同時我們利用Real-time PCR和Western blot檢測細(xì)胞周期蛋白cyclinD1的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)槐果堿可明顯抑制cyclinD1基因和蛋白的表達，同時上調(diào)P27基因的表達。
　　 2.槐果堿可抑制肝腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移
　　 細(xì)胞遷移實驗結(jié)果說明在不抑制細(xì)胞增殖的情況下，槐果堿可明顯降低肝癌細(xì)胞在體外的遷移能力，基底膜侵襲實驗結(jié)果證明槐果堿能使人肝癌細(xì)胞株HCC-LM3、MHCC-97H細(xì)胞體外侵襲能

20、力降低(p＜0.05)。
　　 三、槐果堿誘導(dǎo)分化治療肝癌的機制
　　 1.槐果堿通過下調(diào)AKT/GSK-3β/β-catenin軸逆轉(zhuǎn)肝痛細(xì)胞惡性表型
　　 Ras/MAPK，PI3K/AKT和Wnt/βcatanin通路在腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展中起重要的作用。我們將槐果堿（0，100，200，500，1000μmol/L）處理人肝癌細(xì)胞MHCC-97H和LM324 h后，Western Blot檢測上述通路相關(guān)蛋

21、白的表達情況。結(jié)果顯示PI3K/AKT通路改變最為明顯。我們接著檢測下游p-GSK3β，GSK3β蛋白的變化，結(jié)果顯示p-GSK3β被明顯抑制。GSK3β與多種基因關(guān)系密切，研究發(fā)現(xiàn)p-GSK3β活性被抑制后，GSK3β活性明顯增加，β-catenin活性被抑制，我們發(fā)現(xiàn)β-catenin的活性亦被明顯的抑制。Wnt/β-catenin是維持腫瘤干細(xì)胞自我更新最重要的通路，β-catenin是Wnt/β-catenin通路的一個重要基因

22、，當(dāng)β-catenin失活后，CSCs自我更新能力減弱。我們前面的研究結(jié)果證實槐果堿能有效的抑制β-catenin的mRNA的表達。為進一步驗證GSK3β和β-catenin的關(guān)系，我們用PI3K的激活劑IGF激活p-GSK3β的活性后，Western Blot檢測p-GSK3β和相應(yīng)β-cnienin的變化。同樣，我們用PI3K的抑制劑LY294002抑制p-GSK3β的活性后，Western Blot檢測p-GSK3β的改變和相應(yīng)β

23、-catenin蛋白的變化。
　　 2.槐果堿能下調(diào)TGF-β介導(dǎo)的EMT
　　 我們將TGF-β與槐果堿共同處理24，48 h的人肝癌細(xì)胞株進行real-time PCR和Western Blot檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)槐果堿能明顯上調(diào)E-cad的表達，同時能下調(diào)Vitmentin，N-cad和β-catenin蛋白及基因的表達。
　　 四、槐果堿抑制實驗性小鼠肝癌生長
　　 1.瘤內(nèi)注射槐果堿抑制皮下種植瘤生長

24、
　　 利用Blab/c Nude小鼠做皮下種植瘤形成后，瘤內(nèi)注射35 mg/kg的槐果堿可明顯抑制腫瘤生長，大體照片顯示腫瘤體積明顯縮小，重量明顯減輕，免疫組化結(jié)果顯示槐果堿組Ki67陽性細(xì)胞比例減少。
　　 2.腹腔注射槐果堿抑制肝臟原位種植瘤形成
　　 利用Blab/c Nude小鼠做肝內(nèi)原位種植瘤，待肝臟原位種植瘤形成后，腹腔注射槐果堿，每周5次，共4w。之后分別進行大體觀察和HE染色，結(jié)果顯示槐果堿組腫

25、瘤較生理鹽水組腫瘤明顯縮小。
　　 [討論]:
　　 1.槐果堿可逆轉(zhuǎn)肝腫瘤細(xì)胞株的惡性表型，促進腫瘤細(xì)胞向正常肝細(xì)胞表型分化。
　　 2.槐果堿可有效抑制肝腫瘤細(xì)胞的體外增殖和克隆形成能力，并抑制肝癌細(xì)胞株的侵襲和轉(zhuǎn)移。
　　 3.槐果堿能通過下調(diào)AKT/GSK-3β/β-catenin軸的活性和TGF-β介導(dǎo)的EMT部分參與腫瘤細(xì)胞的誘導(dǎo)分化過程。
　　 4.槐果堿可有效治療實驗性小鼠肝癌，可