青藤堿結(jié)腸定位殼聚糖微球的制備及其對小鼠實驗性結(jié)腸炎的治療作用及其機制.pdf

1、背景和目的：
　　 青藤堿(sinomenine，sN)是傳統(tǒng)中藥青風(fēng)藤的主要藥性成分之一，其藥理作用廣泛：具有抗炎、抗風(fēng)濕、免疫抑制、鎮(zhèn)痛和抗心律失常等作用。青藤堿抑制細(xì)胞和體液免疫、清除活性自由基、改善血管循環(huán)、抑制巨噬細(xì)胞活化、調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的分泌；對眾多免疫活性細(xì)胞亦有作用，并且對類風(fēng)濕和免疫主要相關(guān)疾病具有一定的治療作用。研究證實，炎癥性腸病(inflammatory boweldisease，IBD)具有與免疫類疾病相

2、似的淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫異常的致病過程，IBD的病因和發(fā)病機制目前尚不清楚，已確認(rèn)Toll樣受體(toll like receptor，TLR)信號通路過度激活導(dǎo)致異常的免疫炎癥反應(yīng)從中起重要作用，然而在IBD的發(fā)病過程中青藤堿是否可以起到抑制腸道黏膜TLR信號通路過度激活來減輕炎癥反應(yīng)，此方面研究甚少。為此，本研究將青藤堿用殼聚糖微球作為釋藥載體讓其在結(jié)腸部位定向釋放用于治療葡聚糖硫酸鈉(dextran sulphate sodium，

3、DSS)誘導(dǎo)的小鼠實驗性結(jié)腸炎模型，以及檢測在這一過程中TLRs信號通路中TLR4、MyD88、NF-κB p65及負(fù)性調(diào)控因子SIGIRR的表達，從而觀察青藤堿治療結(jié)腸炎模型的療效，探討其對IBD可能的抗炎機制。
　　 方法：
　　 1.青藤堿殼聚糖微球的制備及體外釋放特性研究
　　 采用醛交聯(lián)法制備青藤堿殼聚糖微球，利用正交試驗并根據(jù)殼聚糖濃度、交聯(lián)劑劑量、油水相體積比、攪拌速度來進行優(yōu)化殼聚糖微球制備條件；

4、使用掃描電鏡及光學(xué)顯微鏡觀察殼聚糖微球的形態(tài)及粒徑分布；采用紫外分光光度法測量分析微球的包裹率、載藥量及釋放率，將微球包裹不同比例的丙烯酸樹脂，測定其在不同溶液介質(zhì)中的釋放度，以評價其緩釋和靶向性。
　　 2.青藤堿聚糖微球?qū)π∈髮嶒炐越Y(jié)腸炎的治療作用及其機制的研究
　　 (1)實驗分組：
　　 ①正常對照組(Normal control group，N)：未建模小鼠給予0.5％羧甲基纖維素鈉鹽溶液；②DSS模型

5、組(Model group，M)：建模小鼠給予0.5％羧甲基纖維素鈉鹽溶液；③柳氮磺吡啶組(Salicylazosulfapyridine，SASP)：建模小鼠給予100mg/kgSASP羧甲基纖維素鈉鹽溶液；④空殼聚糖微球組(Chitosan microspheregroup，C)：建模小鼠給予540mg/kg空殼聚糖微球的羧甲基纖維素鈉鹽溶液；⑤鹽酸青藤堿低劑量組(Low dose sinomenine group，LSN)：建模小

6、鼠給予30mg/kg鹽酸青藤堿的羧甲基纖維素鈉鹽溶液；⑥鹽酸青藤堿中劑量組(Middle dosesinomenine group，MSN)：建模小鼠給予90mg/kg鹽酸青藤堿的羧甲基纖維素鈉鹽溶液；⑦鹽酸青藤堿高劑量組(High dose sinomenine group，HSN)：建模小鼠給予270mg/kg鹽酸青藤堿的羧甲基纖維素鈉鹽溶液；⑧青藤堿微球低劑量組(Low dose sinomenine microsphere gr

7、oup，LSNM)：建模小鼠給予180mg/kg(含青藤堿30mg)微球的羧甲基纖維素鈉鹽溶液；⑨青藤堿微球中劑量組(Middledose sinomenine microsphere group，MSNM)：建模小鼠給予540mg/kg(含青藤堿90mg)微球的羧甲基纖維素鈉鹽溶液；⑩青藤堿微球高劑量組(High dosesinomenine microsphere group，HSNM)：建模小鼠給予1.6g/kg(含青藤堿270m

8、g)微球的羧甲基纖維素鈉鹽溶液。以羧甲基纖維素鈉為藥物賦形劑助懸，以上各組均以0.5％的羧甲基纖維素鈉鹽溶液為溶媒，青藤堿微球組以載藥量同等于青藤堿組給藥；每組6只小鼠，每次每天0.2ml灌胃。
　　 (2)DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎模型的建立和藥物治療：
　　 BALB/c小鼠自由飲用5％DSS溶液7天，然后停止飲用DSS改為清潔飲用水至第10天，建立小鼠急性結(jié)腸炎模型。將正常對照組只飲用清潔飲水并僅給予0.5％羧甲基纖維素

9、鈉溶液灌胃作為對照組。在造模第2天開始，分別按上述分組的藥物劑量給藥，每天1次，直至第10天實驗結(jié)束。處死小鼠，取標(biāo)本待測。
　　 (3)各項指標(biāo)的觀察和檢測：
　　 ①觀察每天各組小鼠體重、疾病活動指數(shù)DAI；②肉眼觀察小鼠結(jié)腸大體形態(tài)改變，HE染色觀察病理組織學(xué)改變；③RT-PCR方法檢測小鼠結(jié)腸組織中TLR4、MyD88、SIGIRR mRNA的表達；④Western blot法檢測小鼠結(jié)腸組織中TLR4、MyD8

10、8、SIGIRR蛋白的表達；⑤免疫組織化學(xué)染色檢測小鼠結(jié)腸組織中MyD88和NF-κBp65蛋白的表達。
　　 結(jié)果：
　　 1.青藤堿殼聚糖微球的制備及體外釋放特性研究
　　 根據(jù)影響青藤堿殼聚糖微球制備因素，采用正交設(shè)計優(yōu)化條件的篩選，得出殼聚糖濃度15mg/ml，水相：油相體積比1:10，交聯(lián)劑3ml，攪拌速度600rpm，溫度40℃，攪拌4h制備的微球通過顯微鏡觀察10μm-60μm的微球占總數(shù)的33.5

11、8％。掃描電鏡觀察結(jié)果顯示成球性好，形態(tài)圓整，粘連少。測得平均粒徑15.61±7.50μm，平均載藥量為19.10±4.51％，平均包封率為59.00±13.26％，在經(jīng)丙烯酸樹脂Ⅱ、Ⅲ包裹后平均粒徑達到20.72±8.03μm，包封率為67.67±1.20％。微球在PH動態(tài)藥物釋放中前3h人工胃液(PH1.2)和胃腸混合液(PH4.5)不釋藥；在人工腸液(PH6.8)2h釋藥小于7％，在人工大腸液(PH7.4)24h釋藥接近60％，而

12、在含大鼠結(jié)腸內(nèi)容物中24h釋藥可達70％。按此優(yōu)化處方及工藝制備的用丙烯酸樹脂包衣的青藤堿殼聚糖微球具有良好的形態(tài)和包封率，并且符合結(jié)腸定向釋藥的要求。
　　 2.青藤堿殼聚糖微球?qū)π∈髮嶒炐越Y(jié)腸炎的治療作用及其機制的研究
　　 (1)小鼠結(jié)腸長度、體重及DAI積分變化
　　 ①對照組小鼠結(jié)腸結(jié)腸全長為9.88±0.50cm。模型組和空殼聚糖微球組長度縮短至7.15±1.38cm和7.18±0.45cm，較對照組

13、有明顯縮短(P<0.05)。除低劑量青藤堿組結(jié)腸長度為7.48±0.89cm，與模型組無明顯差異(P>0.05)。其余各治療組為SASP組長度為8.67±0.75cm，中、高劑量青藤堿為8.83±1.00cm、9.30±0.56cm，低、中、高劑量青藤堿微球組分別為9.51±0.66cm、9.73±0.83cm、9.75±1.28cm，較模型組有顯著差異(P<0.05)。除對照組外各組小鼠在造模后體重開始下降，實驗第4天體重下降至最低點

14、，同時治療后逐漸開始回升。在實驗第5-10天治療組體重明顯回升，但模型組與空殼聚糖組小鼠體重不斷減輕，與各用藥物組體重下降百分比均有顯著差異(P<0.001，0.05)。在實驗各天數(shù)中SASP組、青藤堿組和青藤堿微球組均較對照組體重有所下降但無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，各治療組間也無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。
　　 ②各組小鼠DAI積分在實驗第5、10天有顯著差異，對照組的DAI積分顯著低于模型組和各藥物組(P<0.001)

15、；實驗第5天(按對照組、模型組、SASP組、空殼聚糖組、青藤堿低中高劑量組、青藤堿微球低中高劑量組順序)DAI評分：0、8.67±1.51、3.17±0.41、9.17±0.41、1.50±0.55、0.83±1.17、0.67±1.21、1.17±1.17、0.17±0.41、0.50±0.41，各用藥組積分要顯著低于模型組與空殼聚糖組(P<0.001)，青藤堿中、高劑量組與青藤堿微球低、中、高劑量組間比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)

16、。實驗進行到第10天各用藥組顯著低于模型組和空殼聚糖組(P<0.001)，用藥各組其DAI均有不同程度的降低且呈時間依賴型，組間無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
　　 (2)小鼠結(jié)腸病理學(xué)改變
　　 ①小鼠腸黏膜大體形態(tài)：正常對照組小鼠結(jié)腸黏膜未見充血、水腫、糜爛和潰瘍，模型組和空殼聚糖組可見結(jié)腸黏膜明顯充血、水腫、脹氣、潰瘍和糜爛。SASP組、青藤堿中、高劑量組和青藤堿微球低、中、高組結(jié)腸黏膜充血、水腫較模型組及空殼聚糖

17、組明顯改善；各治療組結(jié)腸肉眼觀察均未見明顯糜爛和潰瘍。
　　 ②小鼠結(jié)腸病理組織學(xué)嚴(yán)重度評分：不同劑量青藤堿組小鼠結(jié)腸病理組織學(xué)評分中無論是結(jié)腸炎癥程度、病變深度及隱窩破壞，各組間評分有顯著差異(F=35.69，P<0.001；F=27.98，P<0.001；F=10.79，P<0.001)，兩兩組間比較正常對照組均顯著低于模型組及各藥物組(P<0.001，0.005，0.05)；SASP組和青藤堿中、高劑量組顯著低于模型組和青

18、藤堿低劑量組(P<0.01，0.05)且組間無明顯差異。同一劑型不同劑量青藤堿微球組小鼠結(jié)腸病理組織學(xué)評分中各組間有顯著差異(F=74.57，P<0.001；F=72.81，P<0.001；F=54.29，P<0.001)，兩兩組間比較顯示模型組和空殼聚糖組要顯著高于對照組和青藤堿微球各組(P<0.001，0.05)，SASP組與青藤堿微球中、高劑量組無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。青藤堿與青藤堿微球同等劑量組小鼠結(jié)腸病理組織學(xué)評分中，青

19、藤堿組要顯著高于青藤堿微球?qū)?yīng)的同等劑量組(P<0.001，0.005，0.05)。
　　 (3)小鼠結(jié)腸組織中TLR4表達
　　 ① TLR4mRNA的表達在不同劑量青藤堿組間有顯著差異(F=100.40，P<0.001)，進行兩兩組間比較發(fā)現(xiàn)：模型組顯著高于對照組和各用藥組(P<0.01)，青藤堿低、中、高劑量組，呈劑量依賴性下降，除青藤堿低劑量組外，青藤堿中、高劑量組與SASP組無顯著差異(P>0.05)。同一劑型

20、不同劑量青藤堿微球組間有顯著差異(F=157.50，P<0.001)，進行兩兩組間比較發(fā)現(xiàn)：模型組與空殼聚糖組顯著高于對照組與青藤堿微球各劑量組(P<0.01)。SASP組顯著高于青藤堿微球中、高劑量組(P<0.01)，且青藤堿微球劑量組間呈劑量依賴性降低。青藤堿各劑量組顯著高于同等青藤堿微球組(P<0.01)，
　　 ② TLR4蛋白的表達在不同劑量青藤堿各組間有顯著差異(F=64.13，P<0.001)，兩兩組間比較發(fā)現(xiàn)：模

21、型組顯著高于對照組和各用藥組(P<0.01)，青藤堿低、中、高劑量組要顯著高于SASP組(P<0.01)，呈劑量依賴性下降，且低劑量組顯著高于高劑量組(P<0.01)。同一劑型不同劑量青藤堿微球各組間有顯著差異(F=118，38，P<0.001)，兩兩組間比較模型組與空殼聚糖組顯著高于對照組與青藤堿微球各劑量組(P<0.01)。SASP組顯著低于青藤堿微球低劑量組(P<0.01)，且與微球中、高劑量組無顯著差異(P>0.05)，青藤堿微

22、球劑量組間呈劑量依賴性降低。青藤堿各劑量組顯著高于同等青藤堿微球組(P<0.01)
　　 (4)小鼠結(jié)腸組織中MyD88表達
　　 ① MyD88mRNA的表達在不同劑量青藤堿各組間有顯著差異(F=18.26，P<0.001)，兩兩組間比較模型組要顯著高于對照組(P<0.01)，且與青藤堿低劑量組無顯著差異。SASP組與青藤堿高劑量組無顯著差異(P>0.05)，青藤堿劑量組間呈劑量依賴性下降。同一劑型不同劑量青藤堿微球各

23、組間有顯著差異(F=29.02，P<0.001)，組間兩兩比較顯示模型組與空殼聚糖組要顯著高于對照組與各治療組(P<0.01)，SASP組與青藤堿微球各劑量組間無明顯差異(P>0.05)，且青藤堿微球劑量組間呈劑量依賴性下降。青藤堿與等同劑量的青藤堿微球低、中劑量組間有顯著差異(P<0.05)，青藤堿高劑量組高于青藤堿微球高劑量組，但無統(tǒng)計學(xué)差異(t=1.06，P=0.313)。
　　 ② MyD88蛋白的表達在不同劑量青藤堿各

24、組間有顯著差異(F=19.33，P<0.001)，兩兩組間比較模型組要顯著高于對照組和各治療組(P<0.01)。SASP組與青藤堿中、高劑量組無顯著差異(P>0.05)，青藤堿各劑量組間呈劑量依賴性下降。同一劑型不同劑量青藤堿微球各組間有顯著差異(F=17.21，P<0.001)，在兩兩組間比較顯示模型組與空殼聚糖組要顯著高于對照組與各治療組(P<0.01)，SASP組與青藤堿微球各劑量組間無明顯差異(P>0.05)，且青藤堿微球劑量組

25、間呈劑量依賴性下降。青藤堿各劑量組顯著高于同等劑量的青藤堿微球組(P<0.05)。
　　 ③小鼠結(jié)腸黏膜炎性細(xì)胞MyD88蛋白的表達積分在不同劑量青藤堿各組間有顯著差異(H=22.642，P<0.001)，兩兩組間比較模型組要顯著高于對照組和各治療組(P<0.01)。SASP組與青藤堿中、高劑量組無顯著差異(P>0.05)。同一劑型不同劑量青藤堿微球各組間有顯著差異(H=28.606，P<0.001)，兩兩組間比較模型組與空殼聚

26、糖組要顯著高于對照組與各治療組(P<0.01)，SASP組與青藤堿微球各劑量組間無明顯差異(P>0.05)，且青藤堿微球劑量組間呈劑量依賴性下降。青藤堿各劑量組要高于同等青藤堿微球組，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
　　 (5)小鼠結(jié)腸組織中SIGIRR表達
　　 ① SIGIRR mRNA的表達在不同劑量青藤堿各組間有顯著(F=34.20，P<0.001)，兩兩組間比較中模型組顯著低于對照組和各用藥組(P<0.01)

27、，SASP組與青藤堿各劑量組間無顯著性差異(P>0.05)。在同一劑型不同劑量青藤堿微球各組間有顯著差異(F=45.53，P<0.001)，兩兩組間比較模型組與空殼聚糖組顯著低于對照組與各治療組(P<0.01)，SASP組與青藤堿微球各劑量組間無顯著差異(P>0.05)，且呈劑量依賴性上升。青藤堿與同等劑量的青藤堿微球低、中劑量組間無統(tǒng)計學(xué)意義(t=-2.07，P=0.066；t=0.24，P=0.817)，青藤堿微球高劑量組要顯著高于

28、青藤堿高劑量組(t=-4.34，P=0.001)。
　　 ② SIGIRR蛋白的表達在不同劑量青藤堿各組間有顯著差異(F=22.30，P<0.001)，兩兩組間比較模型組顯著低于對照組和各用藥組(P<0.01)，SASP組顯著高于青藤堿低劑量(P<0.01)，且與中、高組間無顯著性差異(P>0.05)，青藤堿劑量組間呈劑量依賴性升高。在同一劑型不同劑量青藤堿微球各組間有顯著差異(F=16.98，P<0.001)，兩兩組間比較顯示

29、模型組與空殼聚糖組要顯著低于對照組與各治療組(P<0.01)，SASP組與青藤堿微球各劑量組間無顯著差異(P>0.05)。青藤堿低劑量要顯著低于等同劑量的青藤堿微球低劑量組(t=-2.07，P=0.020)，青藤堿中、高劑量組要高于同等劑量青藤堿微球組，但組間無統(tǒng)計學(xué)意義(t=-0.91，P=0.386；t=0.64，P=0.536)。
　　 (6)小鼠結(jié)腸黏膜NF-kBp65表達
　　 在不同劑量青藤堿組小鼠結(jié)腸黏膜炎

30、性細(xì)胞NF-kB p65蛋白的表達積分在各組間有顯著差異(H=31.016，P<0.001)，模型組要顯著高于對照組和各治療組(P<0.01)。SASP組與青藤堿高劑量組無顯著差異(P>0.05)，顯著低于青藤堿低、中劑量組(P<0.01)，青藤堿劑量組間呈劑量依賴性下降。在同一劑型不同劑量青藤堿微球各組間有顯著差異(H=35.351，P<0.001)，模型組與空殼聚糖組要顯著高于對照組與各治療組(P<0.01)，SASP組與青藤堿微球

31、各劑量組間無明顯差異(P>0.05)，且青藤堿微球劑量組間呈劑量依賴性下降。青藤堿各劑量組顯著高于同等劑量青藤堿微球組(P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.本研究以正交優(yōu)化實驗篩選的青藤堿殼聚糖微球制備條件所制備的殼聚糖微球其粒徑分布、包封率、載藥量和釋放度符合結(jié)腸定向釋放制劑的要求。
　　 2.DSS誘導(dǎo)的小鼠實驗性結(jié)腸炎腸組織中TLR4、MyD88、NF-kB p65表達增加，而SIGIRR的表達降低。

32、提示TLRs/NF-kB信號通路過度活化和它的負(fù)性調(diào)控機制的減弱參與了IBD的致病。
　　 3.青藤堿和青藤堿殼聚糖微球可減輕實驗性結(jié)腸炎小鼠的癥狀、炎癥和病理損傷，結(jié)腸組織中TLR4、MyD88和NF-kBp65的表達顯著下降，而SIGIRR的表達有劑量依賴性上調(diào)，提示青藤堿可能通過抑制TLRs/NF-kB的激活和對SIGIRR的負(fù)性調(diào)控減輕結(jié)腸組織炎癥反應(yīng)。
　　 4.同等劑量的青藤堿微球組在對小鼠實驗性結(jié)腸炎癥狀和