在胃癌細(xì)胞表面構(gòu)建α-gal表位的研究.pdf

1、利用pET-15b表達(dá)系統(tǒng)以可溶性形式在大腸桿菌中表達(dá)鼠源性α-1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的催化結(jié)構(gòu)域，利用其在人胃癌細(xì)胞表面構(gòu)建α-gal表位(Galα1-3Gal-β1-4GlcNAc-R)，擬用來制備一種新的自體腫瘤疫苗。該蛋白由于缺少了跨膜區(qū)及胞質(zhì)區(qū)域，保證了它的可溶性。帶有His-tag的目標(biāo)蛋白分子量約為35kDa。利用高效液相色譜陰離子交換柱分離、分析酶的底物尿嘧啶二磷酸半乳糖和催化產(chǎn)物尿嘧啶二磷酸以檢測(cè)酶的活性。根據(jù)在260

2、nm波長(zhǎng)測(cè)得尿嘧啶二磷酸半乳糖的減少量及尿嘧啶二磷酸的生成量，計(jì)算得到酶的活性為1.75U/ml。利用α-1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的催化結(jié)構(gòu)域在人胃癌細(xì)胞表面構(gòu)建α-gal表位，先與人血清孵育，F(xiàn)ITC標(biāo)記的羊抗人的IgG為第二抗體，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度，以分析α-gal表位的表達(dá)結(jié)果。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示酶反應(yīng)組的熒光強(qiáng)度明顯高于沒有α-1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的對(duì)照組，證明了在胃癌細(xì)胞表面成功構(gòu)建了α-gal表位，為該方法的臨床治