構(gòu)建人巨核祖細(xì)胞-胃癌細(xì)胞融合體生成血小板的實驗研究.pdf

1、目的：
　　 探討通過聚乙二醇(PEG)細(xì)胞化學(xué)融合法構(gòu)建人臍帶血巨核祖細(xì)胞/胃癌SGC7901細(xì)胞融合體，并通過RPMI1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)使其產(chǎn)生功能性血小板的可行性。這一研究可為臨床大量制備血小板提供一種新方法。
　　 方法：
　　 第一部分：人臍帶血干細(xì)胞體外擴(kuò)增為巨核祖細(xì)胞及胃癌SGC7901細(xì)胞的復(fù)蘇培養(yǎng)。用免疫磁珠分選人臍帶血CD34+細(xì)胞，通過RPMI1640培養(yǎng)基體外靜態(tài)培養(yǎng)，加入定向分化因子

2、促血小板生成素(TPO)、Flt-3 配體(FL)、白介素-3(IL-3)、白介素-6(IL-6)產(chǎn)生巨核祖細(xì)胞，并對其培養(yǎng)7天(d)的增殖程度進(jìn)行觀察，檢測其表面標(biāo)志CD41、CD61的表達(dá)水平；復(fù)蘇胃癌SGC7901細(xì)胞。第二部分：采用PEG 化學(xué)融合法制備巨核祖細(xì)胞/胃癌SGC7901細(xì)胞融合體，HAT 篩選系統(tǒng)分選融合細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)；流式細(xì)胞計數(shù)儀(FACS)檢測培養(yǎng)孔上層液中類血小板顆粒表面CD41、CD62p的表達(dá)情況，瑞氏

3、染色觀察顆粒形態(tài)，血小板聚集試驗、粘附試驗檢測其功能，并與正常單采血小板(保存5d)作比較。
　　 結(jié)果：
　　 1.CD34+細(xì)胞培養(yǎng)及胃癌SGC7901細(xì)胞復(fù)蘇：臍帶血CD34+細(xì)胞培養(yǎng)第7d，可見細(xì)胞生長旺盛，出現(xiàn)許多集落。胃癌SGC7901細(xì)胞復(fù)蘇第3d，細(xì)胞處于對數(shù)生長期。
　　 2.巨核祖細(xì)胞表面標(biāo)志鑒定：免疫磁珠分選的臍帶血CD34+細(xì)胞計數(shù)，培養(yǎng)第7d，增殖達(dá)80倍，同時流式細(xì)胞儀檢測其表面標(biāo)志C

4、D41和CD61，測得其雙陽性率第1d為13.59±2.20％，第7d上升至30.66±2.38％。
　　 3.細(xì)胞融合及類血小板顆粒產(chǎn)生：巨核祖細(xì)胞與胃癌細(xì)胞融合第1d，倒置顯微鏡下可見兩細(xì)胞間部分胞質(zhì)胞膜已融合，融合部分胞膜完整連續(xù)，體積變大，形態(tài)規(guī)則。
　　 融合后第10d細(xì)胞多呈圓形，單個存在，生長狀態(tài)良好。觀察細(xì)胞融合率(細(xì)胞效靶比：10:1)，融合后細(xì)胞計數(shù)可達(dá)(2.03±1.08)×106，融合率為36.9

5、1±1.08％。融合細(xì)胞培養(yǎng)動態(tài)計數(shù)：隨著培養(yǎng)時間的延長，融合細(xì)胞培養(yǎng)10d，第1、3、5、10d分別計數(shù)，細(xì)胞濃度分別為：(5.00±0.00)×104/ml、(7.30±0.29)×104/ml、(1.50±0.56)×105/ml、(2.30±0.93)×105/ml，平均增殖約4倍。產(chǎn)生的類血小板顆粒動態(tài)計數(shù)，第1、3、5、10d分別為：0、(5.00±0.12)×105/ml、(2.60±0.88)×106/ml、(6.10±

6、1.21)×106/ml。
　　 4.類血小板顆粒鑒定：
　　 ①形態(tài)觀察：融合細(xì)胞培養(yǎng)10d，取其培養(yǎng)上層液沉淀顆粒與正常血小板瑞氏染色后比較，其形態(tài)相似。
　　 ②聚集功能鑒定：正常單采血小板和融合細(xì)胞培養(yǎng)10d后獲得的上層液中沉淀顆粒在未加凝血酶時呈散在分布；加入凝血酶后，兩者均發(fā)生聚集，且其凝集強(qiáng)度相似，表示類血小板顆粒具有正常血小板相似的聚集功能。
　　 ③黏附功能鑒定：.融合細(xì)胞培養(yǎng)10d 產(chǎn)

7、生的類血小板顆粒和正常單采血小板的粘附率分別為40.43±1.63％和35.53±4.06％，兩者間無明顯差異(t=1.94，P>0.05)。
　　 ④表面標(biāo)志測定：融合細(xì)胞培養(yǎng)10d 產(chǎn)生的類血小板顆粒和正常單采血小板分別進(jìn)行血小板表面CD41、CD62p 檢測，兩者CD62p(血小板活化指標(biāo))表達(dá)相似(t=2.24，P>0.05)，CD41表達(dá)在類血小板顆粒中明顯減少(t=6.59，P<0.05)。
　　 結(jié)論：