乙肝扶正排毒膠囊體外抗乙肝病毒及對(duì)NF-kb活化干預(yù)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的： 肝癌HepG2.2.15細(xì)胞株廣泛應(yīng)用于HBV生活周期、發(fā)病機(jī)理、免疫效應(yīng)細(xì)胞及抗病毒藥物評(píng)價(jià)等研究，是申報(bào)肝炎新藥必備的抗病毒實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?近年的研究表明，中藥有較好的改善乙肝病人的臨床癥狀、保肝降酶退黃及抗乙肝病毒(HBV)的作用，而且副作用少，經(jīng)濟(jì)適用，極具開發(fā)價(jià)值。研制生產(chǎn)有效、安全、方便的乙型肝炎抗病毒藥物眾人翹首以待。乙肝扶正排毒膠囊組成有虎杖、白花蛇舌草、蚤休、苦味葉下珠、露蜂房、赤芍、丹參、生黃芪、

2、制首烏等。方中黃芪、首烏、白花蛇舌草等具有促進(jìn)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，調(diào)整T細(xì)胞亞群比例，增強(qiáng)免疫功能，提高LAK細(xì)胞和NK細(xì)胞活性，誘導(dǎo)干擾素等作用?；⒄?、白花蛇舌草、苦味葉下珠等具有抗病毒、抑制HBV-DNA聚合酶的作用，露蜂房、赤芍、丹參活血化瘀，減輕肝細(xì)胞損傷，改善肝細(xì)胞供氧，促進(jìn)其恢復(fù)。但是，其機(jī)理并不清楚。為了深入探討其治療慢性乙型肝炎的抗病毒作用機(jī)制，從實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)的角度進(jìn)一步論證乙肝扶正排毒膠囊抗乙肝病毒的機(jī)理，我們以HepG2.2.

3、15細(xì)胞株為乙肝抗病毒模型進(jìn)行藥物的抗病毒實(shí)驗(yàn)和NF-κB活化的實(shí)驗(yàn)研究。 方法： 1.乙肝扶正排毒膠囊含藥血清的制備： 清潔級(jí)、健康Wistar大鼠4只，雌雄各半，由南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物飼養(yǎng)中心提供。自由飲水，喂飼南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的鼠顆粒飼料。乙肝扶正排毒膠囊，成人每日臨床劑量0.3g×12粒=3.6g，天晴復(fù)欣膠囊是其三分之一，1.2g/d，余操作均參照此比例。設(shè)計(jì)大鼠每次灌胃乙肝扶正排毒膠囊水溶劑1

4、ml/200g，中劑量=臨床成人劑量3.6g×0.018×5=0.162g/kg·次，大鼠灌胃參照王寧生文獻(xiàn)報(bào)道，擬用推薦中劑量10倍量制備含藥血清以保證對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞系有較佳抑制效果，配成的實(shí)驗(yàn)用藥濃度0.162g/ml，早晚各1次，用量分別相當(dāng)于臨床成人劑量10倍，連續(xù)7天，從預(yù)養(yǎng)的4只大鼠中任選一只大鼠等體積生理鹽水灌胃做為空白對(duì)照。于最后一次灌胃后2h(灌胃前禁食不禁水12h)腹主動(dòng)脈取血，無菌分離血清，血清經(jīng)56℃30min滅活，

5、置-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?2.HepG2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)： 將HepG2.2.15細(xì)胞置于含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，DMEM中加入380mg/LG418，150mL/L胎牛血清，2mmol/L谷氨酰胺，10mL/L青、鏈霉素，用50g/LNaHCO3調(diào)PH7.2～7.4培養(yǎng)，于5％CO2，37℃條件下培養(yǎng)，隔日更換培養(yǎng)液一次。 3.細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)： 乙肝扶正排毒膠囊以培養(yǎng)基等倍稀釋從25mg/m

6、l、12.5mg/ml、6.25mg/ml、3.125mg/ml、1.56mg/ml、0.781mg/ml(陽性對(duì)照藥物天晴復(fù)欣膠囊濃度為其三分之一)，加入96孔培養(yǎng)板中，每濃度平行4孔，4天后更換同濃度藥物，同時(shí)設(shè)僅加培養(yǎng)基無藥對(duì)照組。中藥含色素，不宜采用MTT方法。實(shí)驗(yàn)8天后在鏡下觀察。細(xì)胞形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)方法采用顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化(CPE法)，細(xì)胞形態(tài)與增殖生長(zhǎng)改變(病變指數(shù))和藥物效應(yīng)關(guān)系分為五個(gè)等級(jí)。0度：細(xì)胞形態(tài)正常無任何反應(yīng)

7、，增殖生長(zhǎng)能力無改變。1度：細(xì)胞增殖速度減緩，分裂數(shù)下降。鏡下見細(xì)胞輪廓增強(qiáng)，反差增大，但細(xì)胞仍增殖生長(zhǎng)。2度：細(xì)胞增殖非常緩慢，細(xì)胞分裂指數(shù)顯著下降或接近消失。細(xì)胞輪廓非常明顯，胞質(zhì)粗糙，內(nèi)有顆粒堆積。3度：細(xì)胞增殖完全停止，分裂相消失，細(xì)胞體回縮，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞輪廓非常明顯，胞質(zhì)極度粗糙，內(nèi)充滿少量堆積物。4度：大量細(xì)胞脫離死亡，殘余細(xì)胞亦瀕臨死亡或崩裂溶解。結(jié)果用Reed-Meuench法計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的半數(shù)毒性濃度(TC

8、50)和最大無毒濃度(TC0)。 4.藥物對(duì)HBV的抑制實(shí)驗(yàn)： 抗HBV效果以治療指數(shù)(TI)評(píng)價(jià)，TI=半數(shù)毒性濃度(TC50)/半數(shù)抑制劑量(D50)。以藥物作用8天的TI為標(biāo)準(zhǔn)，TI＞2為有效，TI=1為有毒有效，TI＜1為毒性作用。 根據(jù)以上最大無毒濃度(TC0)分別取乙肝扶正排毒膠囊和天晴復(fù)欣膠囊，乙肝扶正排毒膠囊組用培養(yǎng)基配制成高濃度A1組(0.8×TC0)、中濃度A2組(0.4×TC0)、低濃度A3

9、組(0.2×TC0)三個(gè)梯度濃度，同樣方法天晴復(fù)欣膠囊組用培養(yǎng)基配制成高中低濃度三個(gè)梯度濃度組B1組、B2組、B3組，含藥血清為C組，空白血清為D組，未加藥細(xì)部培養(yǎng)組為E組，分別加入24孔板中，每孔1mL，每濃度平行8孔，置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。第4天吸取培養(yǎng)液，更換相同濃度的藥液繼續(xù)培養(yǎng)，第8天收集培養(yǎng)液上清。將兩次收集的培養(yǎng)液同時(shí)測(cè)定HBsAg、HBeAg的吸光度值(HBV-DNA取其拷貝數(shù)值，下同)。同時(shí)以不含藥培養(yǎng)液培

10、養(yǎng)的HepG2.2.15細(xì)胞上清液HBsAg和HBeAg的效價(jià)為對(duì)照，記錄無藥物細(xì)胞對(duì)照及給藥組各濃度每孔吸光值，以無藥物細(xì)胞對(duì)照組的平均吸光度值為100，無細(xì)胞對(duì)照孔吸光值為空白對(duì)照，計(jì)算藥物各濃度的抑制百分率(％)。各培養(yǎng)細(xì)胞組取上清液后立即置-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。ELISA法檢測(cè)HBeAg及HBsAg，定量熒光PCR檢測(cè)HBV-DNA。操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。 5.核因子NF-κB活化干預(yù)實(shí)驗(yàn)： SP法免疫組

11、織化學(xué)染色檢測(cè)NF-κB因子P65，操作流程按說明書進(jìn)行。胞核胞漿染成棕黃色為陽性。計(jì)數(shù)者采取雙盲法對(duì)每張細(xì)胞爬片弓字線路計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞中陽性細(xì)胞數(shù)目，陽性細(xì)胞數(shù)與細(xì)胞總數(shù)的比值即陽性細(xì)胞率。計(jì)數(shù)十張涂片取得10個(gè)陽性細(xì)胞率數(shù)據(jù)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用以表示NF-κB的胞核表達(dá)強(qiáng)度。 結(jié)果： 1.細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果：顯微鏡檢(CPE)結(jié)果用Reed-Meuench法計(jì)算TC50乙肝扶正排毒膠囊為6.61mg/ml，天晴復(fù)欣膠

12、囊為4.11mg/ml。最大無毒劑量乙肝扶正排毒膠囊TC0＜2.81mg/ml，天晴復(fù)欣膠囊TC0＜1.45mg/ml。 2.HBV抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果：乙肝扶正排毒膠囊TC50為6.61mg/ml，對(duì)HBsAgID50為1.26mg/ml，治療指數(shù)(TI)為5.25。乙肝扶正排毒膠囊對(duì)HBeAg的ID50為1.02mg/ml，治療指數(shù)6.48。乙肝扶正排毒膠囊對(duì)HBV-DNA的ID50為0.86mg/ml，治療指數(shù)7.69，遠(yuǎn)高于2，

13、提示乙肝扶正排毒膠囊安全有效。相同情況下天晴復(fù)欣膠囊治療指數(shù)為4.46、6.07和6.69。由于加入HepG2細(xì)胞模型刺激因素分別為膠囊和血清，抑制劑量上無可比性，故含藥血清C組和空白血清D組與膠囊組A、B組另外分別比較。膠囊組各組數(shù)據(jù)因?yàn)橛械?天和第8天兩個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)，故用SPSS10.0軟件的析因設(shè)計(jì)方差分析，結(jié)果乙肝扶正排毒膠囊和天晴復(fù)欣膠囊不同組間、不同時(shí)間點(diǎn)、高低中三個(gè)劑量間均有顯著性差異(P＜0.01)，說明乙肝扶正排毒膠囊

14、和天晴復(fù)欣膠囊都存在著劑量越大，病毒抑制效果越好的量效關(guān)系，并且第8天的病毒抑制效果優(yōu)于第4天，以第8天乙肝扶正排毒膠囊高劑量A1組HBV-DNA抑制率81.8±5.7％為最高。含藥血清C組和空白血清D組之間第4天和第8天時(shí)間點(diǎn)，用SPSS10.0軟件的獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，結(jié)果各指標(biāo)均有顯著性差異(P＜0.05)，說明含藥血清組抑制對(duì)HBV抑制效果優(yōu)于空白血清，第8天時(shí)各孔HBV-DNA均轉(zhuǎn)陰。 3.核因子NF-κB陽性細(xì)胞百分

15、率結(jié)果：數(shù)據(jù)采用單向方差分析(One-wayANOVA)，結(jié)果各組間具有顯著性差異(F=115.757，P=0.001)，多重均數(shù)之間的兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，各組間除未加刺激的空白對(duì)照組和空白血清組、乙肝扶正排毒A2組和天晴復(fù)欣B1組、A3組和B2組及B2組和B3組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，其余均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 4.乙肝扶正排毒膠囊A1組、A2組、A3組第8天HBsAg抑制率與核因子NF-κB陽性細(xì)胞

16、百分率相關(guān)性統(tǒng)計(jì)結(jié)果：乙肝扶正排毒膠囊A1組、A2組、A3組第8天HBsAg與核因子NF-κB陽性細(xì)胞百分率的數(shù)據(jù)用SPSS10.0軟件的雙變量相關(guān)分析(Bivariat)進(jìn)行分析，Pearson相關(guān)系數(shù)r=0.776，P=0.010(雙側(cè))，結(jié)果乙肝扶正排毒膠囊A1組、A2組、A3組第8天HBsAg與核因子NF-κB陽性細(xì)胞百分率之間存在正相關(guān)關(guān)系，說明隨著NF-κB活化率升高，乙肝扶正排毒膠囊組病毒學(xué)指標(biāo)HBsAg在下降。