CXCR4和CD133共表達(dá)對(duì)Ⅱ-Ⅲ結(jié)腸癌預(yù)后影響的分析.pdf

1、研究背景和目的:
　　 結(jié)腸癌是我國常見的消化道惡性腫瘤，近年來其發(fā)病率呈逐年增高趨勢，結(jié)腸癌的局部復(fù)發(fā)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血行播散性轉(zhuǎn)移是造成結(jié)腸癌患者死亡的主要原因之一。結(jié)腸癌早期即可出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，進(jìn)展期常常會(huì)出現(xiàn)肝臟、肺轉(zhuǎn)移及腹腔播散。目前認(rèn)為結(jié)腸癌的生長、轉(zhuǎn)移涉及多方面的因素，包括腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)抗凋亡、腫瘤細(xì)胞侵襲、腫瘤細(xì)胞遷移、腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視。最近研究表明細(xì)胞因子受體在腫瘤細(xì)胞的表達(dá)直接影響著腫瘤細(xì)胞的淋巴及血行轉(zhuǎn)移，

2、影響著不同腫瘤的轉(zhuǎn)移部位及轉(zhuǎn)移進(jìn)程。細(xì)胞因子受體CXCR4最初是作為調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞在炎癥反應(yīng)中歸巢的重要受體被發(fā)現(xiàn)的，其天然配體是SDF-1（stromalcellderivedfactor-1，基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1），又稱CXCL12。CXCR4目前被證實(shí)是腫瘤細(xì)胞粘附和/或遷移的重要因子，SDF-1在腫瘤常見的轉(zhuǎn)移部位通常存在高表達(dá)，如肺臟、肝臟、淋巴結(jié)。目前認(rèn)為SDF-1-CXCR4生物學(xué)軸是介導(dǎo)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制，例如:在乳

3、腺癌及口腔鱗狀細(xì)胞癌中均發(fā)現(xiàn)CXCR4存在高表達(dá)。
　　 越來越多的證據(jù)支持腫瘤中存在腫瘤干細(xì)胞。所謂的“腫瘤干細(xì)胞”是指那些具有自我更新能力的腫瘤細(xì)胞，其增殖及遷移推動(dòng)了腫瘤的進(jìn)展。目前已在多種實(shí)體瘤中發(fā)現(xiàn)存在腫瘤干細(xì)胞。從最初在造血干細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，到現(xiàn)在CD133已經(jīng)在多種實(shí)體瘤中被認(rèn)為是腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)記物，如:腦膠質(zhì)瘤、乳腺癌、肺癌、肝癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、胰腺癌及黑色素瘤。盡管目前對(duì)于CD133的功能并不是十分清楚，現(xiàn)有證

4、據(jù)表明CD133可能與干細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、腫瘤凋亡抵抗等機(jī)制密切相關(guān)。由于腫瘤干細(xì)胞具有強(qiáng)大的增殖及轉(zhuǎn)移能力，其被認(rèn)為是未來腫瘤治療的靶點(diǎn)。
　　 現(xiàn)有證據(jù)表明CXCR4和CD133參與了腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移及腫瘤惡性生物學(xué)行為的維持，然而，目前并未有同時(shí)研究CXCR4和CD133在結(jié)腸癌中表達(dá)及預(yù)后的報(bào)道。在本研究中，我們分析了CXCR4和CD133在結(jié)腸癌中的表達(dá)及其與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。此外，我們還選取了結(jié)腸癌細(xì)胞株4株，分

5、析其CXCR4和CD133的表達(dá)情況，及其在體外對(duì)SDF-1的趨化遷移能力。
　　 方法:
　　 收集2001年1月至2005年7月在中山大學(xué)第一附屬醫(yī)院行手術(shù)治療的結(jié)腸癌患者石蠟包埋標(biāo)本125例，其中TNM分期Ⅱ期患者61例，Ⅲ期患者64例。所有患者均接受過結(jié)腸癌根治術(shù)，術(shù)后病理確診為結(jié)腸癌，所有患者在手術(shù)前均未接受過新輔助化療或放療?；颊咝g(shù)后接受何種輔助治療均按照NCCN指南根據(jù)相應(yīng)的分期及復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)執(zhí)行。運(yùn)用免疫組化

6、的方法檢測CXCR4和CD133在Ⅱ、Ⅲ期結(jié)腸癌原發(fā)灶及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)。所有病理標(biāo)本均由完全不了解本研究患者相關(guān)臨床資料及預(yù)后的病理科醫(yī)生閱片。并進(jìn)一步運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析CXCR4和CD133在結(jié)腸癌中的表達(dá)情況與患者臨床病理特征及5年生存率之間的關(guān)系。
　　 選取4株人結(jié)腸癌細(xì)胞株:SW480、SW620、HT-29、lovo細(xì)胞，運(yùn)用免疫印跡法檢測4株結(jié)腸癌細(xì)胞株中CXCR4和CD133的表達(dá)情況，并進(jìn)一步運(yùn)用流式細(xì)胞

7、儀檢測結(jié)腸癌細(xì)胞株CXCR4和CD133的表達(dá)情況。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)分析SW480、SW620、HT-29和lovo細(xì)胞在體外對(duì)SDF-1的趨化遷移能力。
　　 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:免疫組織化學(xué)得分與患者臨床病理特征之間的兩樣本率比較采用四格表資料的x2檢驗(yàn)，多樣本率的比較采用行列表資料的x2檢驗(yàn)。如果某一個(gè)分組的樣本特別小，相關(guān)性分析則采用Fisher's精確檢驗(yàn)法。生存分析檢驗(yàn)方法采用log-rank檢驗(yàn)，并通過繪制Kap

8、lan-Meier生存曲線來表現(xiàn)臨床病理特征對(duì)生存的影響。采用SPSS13.0軟件包(SPSSInc.，Chicago，IL，USA)對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。在本研究中以P＜0.05為差異有顯著性意義的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，所有P值均是雙側(cè)檢驗(yàn)分析的結(jié)果。
　　 結(jié)果:
　　 在125例患者中共有102例患者可在同一張切片上找到瘤旁結(jié)腸上皮組織。在102例瘤旁結(jié)腸上皮組織中，CXCR4僅在11例(11/102，10.8％)瘤旁結(jié)腸上皮

9、組織中出現(xiàn)表達(dá);CD133僅在8例(8/102，7.8％)瘤旁結(jié)腸上皮組織中出現(xiàn)表達(dá)。在125例結(jié)腸癌組織中，有74例為CXCR4陽性表達(dá)(74/125，59.2％)。CXCR4表達(dá)的主要形式為細(xì)胞質(zhì)表達(dá)，部分患者可見有細(xì)胞膜表達(dá)，在本研究中并未發(fā)現(xiàn)有細(xì)胞核表達(dá)。在125例結(jié)腸癌組織中，45例發(fā)現(xiàn)存在CD133的表達(dá)(36.0％，45/125)。CD133在結(jié)腸癌中的表達(dá)呈現(xiàn)極性分布，在存在腺體樣分化的結(jié)腸癌中，只有那些與腺腔直接接觸的

10、腫瘤細(xì)胞才有可能表達(dá)CD133，CD133的表達(dá)通常位于腺腔的尖端。一些CD133陽性的腫瘤細(xì)胞通常聚集在一起，導(dǎo)致整個(gè)腺體全部或大部分呈陽性表達(dá)。在125例Ⅱ、Ⅲ期結(jié)腸癌患者中，單獨(dú)分析CXCR4或CD133的表達(dá)與患者臨床病理特征之間的關(guān)系，并未發(fā)現(xiàn)CXCR4或CD133的表達(dá)與患者年齡、性別、原發(fā)灶部位、病理分級(jí)、腫瘤大小、AJCC分期、腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況存在相關(guān)性。
　　 將CXCR4與CD133的表達(dá)結(jié)合在一

11、起分析，我們可以得到四種組合:CXCR4陽性/CD133陽性、CXCR4陽性/CD133陰性、CXCR4陰性/CD133陽性、CXCR4陰性/CD133陰性。結(jié)果發(fā)現(xiàn):125例患者中CXCR4和CD133共表達(dá)（CXCR4陽性/CD133陽性）的患者有29例(23.2％)。分析CXCR4和CD133共表達(dá)與患者各種臨床病理特征之間的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CXCR4與CD133的共表達(dá)與患者AJCC分期(P=0.029)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.02

12、0)有明顯的相關(guān)性，CXCR4與CD133共表達(dá)的患者其AJCC分期更高，且更易出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。
　　 我們同時(shí)選取64例Ⅲ期結(jié)腸癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶，運(yùn)用免疫組織化學(xué)法分析淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中CXCR4和CD133的表達(dá)情況。在64例Ⅲ期結(jié)腸癌患者的原發(fā)灶中，有41例(64.1％)患者高表達(dá)CXCR4，在64例Ⅲ期結(jié)腸癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中有43例(67.2％)高表達(dá)CXCR4。在64例Ⅲ期結(jié)腸癌患者的原發(fā)灶中，有27例(42.2％

13、)患者高表達(dá)CD133，而在64例Ⅲ期結(jié)腸癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中僅有15例(23.4％)高表達(dá)CD133。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中CD133的表達(dá)較原發(fā)灶明顯下降(P=0.024)。在64例Ⅲ期結(jié)腸癌患者的原發(fā)灶中，20例(31.3％)患者存在CXCR4與CD133的共表達(dá)，在64例Ⅲ期結(jié)腸癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中僅有9例(14.1％)患者存在CXCR4與CD133的共表達(dá)。CXCR4與CD133結(jié)合起來分析發(fā)現(xiàn)，CXCR4和CD133共表達(dá)在淋巴

14、結(jié)轉(zhuǎn)移灶中較原發(fā)灶明顯降低（淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶14.1％VS原發(fā)灶31.3％，P=0.020）。
　　 所有患者均進(jìn)行嚴(yán)密隨訪以評(píng)價(jià)CXCR4與CD133的預(yù)后價(jià)值。中位隨訪時(shí)間為6.5年。隨訪過程中共有36例發(fā)生死亡，3例出現(xiàn)失訪。Log-rank生存分析及多因素生存分析均發(fā)現(xiàn):AJCC分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、CXCR4表達(dá)、CD133表達(dá)、CXCR4和CD133共表達(dá)是獨(dú)立的生存預(yù)后因素。運(yùn)用Kaplan-Meier生存曲線分析CXCR

15、4和CD133共表達(dá)的預(yù)后意義，結(jié)果表明:CXCR4和CD133共表達(dá)是顯著預(yù)后不良的因素。在本研究的125例結(jié)腸癌患者中，有29例患者存在CXCR4和CD133共表達(dá)，這29例患者的5年生存率顯著降低，僅為51％，剩余患者的5年生存率為77％(P=0.005)。
　　 運(yùn)用免疫印跡法檢測結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480、SW620、HT-29、lovo細(xì)胞中CXCR4和CD133的表達(dá)情況，結(jié)果顯示:CXCR4在SW480細(xì)胞、SW62

16、0細(xì)胞和HT-29細(xì)胞中表達(dá)水平均較高，免疫印跡法分析CXCR4在上述三株細(xì)胞的表達(dá)水平大致相當(dāng)，但CXCR4在lovo細(xì)胞中表達(dá)水平明顯較上述三株細(xì)胞降低;CD133在四株結(jié)腸癌細(xì)胞株中也均有表達(dá)，其中在SW480細(xì)胞中的表達(dá)最強(qiáng)，在SW620和HT-29細(xì)胞中的表達(dá)稍弱，在lovo細(xì)胞中的表達(dá)最弱。運(yùn)用流式細(xì)胞法檢測結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480、SW620、HT-29、lovo細(xì)胞中CXCR4和CD133的表達(dá)情況，結(jié)果顯示:SW480細(xì)

17、胞是所選四株細(xì)胞中CXCR4和CD133雙陽性細(xì)胞所占比例最高的，其CXCR4和CD133雙陽性細(xì)胞所占的比例為39％;SW620細(xì)胞中CXCR4和CD133雙陽性細(xì)胞所占的比例為26％;HT-29細(xì)胞中CXCR4和CD133雙陽性細(xì)胞所占的比例為23％;lovo細(xì)胞CXCR4和CD133雙陽性細(xì)胞所占的比例在所選四株細(xì)胞中最低，僅為11％。運(yùn)用Transwell遷移實(shí)驗(yàn)分析不同結(jié)腸癌細(xì)胞株的遷移能力，結(jié)果顯示:SW480細(xì)胞侵出小室的

18、細(xì)胞數(shù)目最多，遷移能力最強(qiáng)，平均每個(gè)高倍視野中侵出小室的細(xì)胞數(shù)為82.4±8.5個(gè);SW620和HT-29細(xì)胞侵出小室的細(xì)胞數(shù)目較SW480細(xì)胞少，平均每個(gè)高倍視野中侵出小室的細(xì)胞數(shù)分別為50.4±8.96個(gè)和44.4±8.72個(gè);lovo細(xì)胞侵出小室的細(xì)胞數(shù)目最少，遷移能力最弱，平均每個(gè)高倍視野中侵出小室的細(xì)胞數(shù)為23.5±6.4個(gè)。
　　 結(jié)論:
　　 在125例Ⅱ、Ⅲ期結(jié)腸癌患者中，單獨(dú)分析CXCR4或CD133的

19、表達(dá)與患者各種臨床病理特征之間的關(guān)系，并未發(fā)現(xiàn)存在相關(guān)性。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)CXCR4和CD133共表達(dá)與患者AJCC分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有明顯的相關(guān)性，CXCR4和CD133共表達(dá)的結(jié)腸癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生率顯著升高。生存分析表明CXCR4和CD133共表達(dá)是獨(dú)立的生存預(yù)后因素，存在CXCR4和CD133共表達(dá)的結(jié)腸癌患者5年生存率顯著降低。CXCR4和CD133的表達(dá)在所選的4株結(jié)腸癌細(xì)胞株中存在明顯差異，這種差異影響著腫瘤細(xì)胞在體外對(duì)SD