粉紅螺旋聚孢霉67--1產(chǎn)厚垣孢子相關(guān)基因的篩選與功能研究.pdf

1、粉紅螺旋聚孢霉（Clonostachys rosea）是一類重要的生防真菌，可以防治灰霉菌、核盤菌、立枯絲核菌等多種植物真菌病害，具有很強的生防潛力。目前真菌制劑多為分生孢子制劑，穩(wěn)定性較差，貨架期短。厚垣孢子是真菌在特定條件下產(chǎn)生的一種抗逆結(jié)構(gòu)，對真菌生防制劑的研發(fā)具有重要意義，但迄今關(guān)于生防真菌厚垣孢子形成相關(guān)基因的研究極少。為篩選粉紅螺旋聚孢霉產(chǎn)厚垣孢子相關(guān)基因，本研究以實驗室前期分離的粉紅螺旋聚孢霉高效菌株67-1為材料，通過高

2、通量測序獲得粉紅螺旋聚孢霉67-1菌株產(chǎn)厚垣孢子轉(zhuǎn)錄組，篩選出不同產(chǎn)孢條件下穩(wěn)定表達的適宜內(nèi)參基因，并通過基因敲除，證明己糖激酶基因、聚酮化合物羥化酶基因和醛脫氫酶基因在粉紅螺旋聚孢霉67-1菌株厚垣孢子形成過程中的作用，為揭示厚垣孢子形成機制奠定了基礎(chǔ)。
　　為獲得粉紅螺旋聚孢霉67-1菌株產(chǎn)厚垣孢子相關(guān)基因，本實驗以粉紅螺旋聚孢霉67-1菌株為材料，分別在36h和72 h取樣，通過高通量測序技術(shù)和實時熒光定量PCR獲得粉紅螺旋

3、聚孢霉67-1菌株產(chǎn)孢差異表達基因。轉(zhuǎn)錄組分析獲得549，661，174 clean reads。36h時有67個基因上調(diào)表達，117個基因下調(diào)表達;72h時有53個基因上調(diào)表達，24個基因下調(diào)表達。GO分類注釋差異表達基因與細胞組分、生物學(xué)過程和分子功能相關(guān)。KEGG分析表明，共有188條代謝途徑參與了粉紅螺旋聚孢霉67-1菌株厚垣孢子的形成過程，主要包括次級代謝生物合成和環(huán)境代謝途徑。對16個差異表達基因進行實時熒光定量PCR檢測，

4、表達水平的變化與轉(zhuǎn)錄組分析一致。
　　內(nèi)參基因是基因表達水平準確定量的基礎(chǔ)。為篩選粉紅螺旋聚孢霉67-1菌株產(chǎn)厚垣孢子條件下穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因，選取9個管家基因—肌動蛋白(ACT)、延伸因子1(EF1)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、泛素(UBQ)、泛素結(jié)合酶(UCE)、組氨酸（HIS）、RNA聚合酶Ⅱ CTD磷酸酶Fcp1(RPP)、TATA結(jié)合蛋白（TBP）和琥珀酸-半醛脫氫酶(SSD)，利用實時熒光定量PCR檢測這些

5、基因在粉紅螺旋聚孢霉67-1菌株產(chǎn)厚垣孢子過程中的表達水平，并通過geNorm、NormFinder和BestKeeper三個內(nèi)參軟件分析候選基因的表達穩(wěn)定性。最終篩選出SSD和ACR組合作為內(nèi)參基因用于定量粉紅螺旋聚孢霉67-1菌株在產(chǎn)厚垣孢子過程中的基因表達。
　　通過轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果，分離獲得己糖激酶基因HXK67、聚酮化合物羥化酶基因PKH67和醛脫氫酶基因ALD67。實時熒光定量PCR顯示，與對照相比，在36h和72 h，

6、HXK67表達量分別升高1.8倍、89.1倍，PKH67表達量分別升高11.8倍、25.3倍，ALD67表達量分別升高16.1倍、9.8倍。三個基因生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，HXK67編碼區(qū)總長1602 bp，編碼533個氨基酸，與頂頭孢霉(Acremonium chrysogenum)的己糖激酶相似蛋白同源性為63％。PKH67編碼區(qū)總長1716bp，編碼571個氨基酸，與膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporio

7、ides）中的聚酮化合物羥化酶同源性為61％。ALD67編碼區(qū)總長975 bp，編碼324個氨基酸，與膠孢炭疽菌（Colletotrichumgloeosporioides）中的醛脫氫酶同源性為49％。用同源重組方法構(gòu)建HXK67、PKH67和ALD67的敲除載體，并用PEG4000-CaCl2介導(dǎo)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法成功得到HXK67的缺失突變株ΔHXK67，突變株ΔHXK67的生長速率較野生菌株顯著性提高，但產(chǎn)厚垣孢子能力和對尖孢鐮刀