土壤中粉紅粘帚霉67-1熒光定量PCR監(jiān)測體系的建立及應用.pdf

1、利用粉紅粘帚霉等生防菌制劑防治水稻紋枯病是當前極有潛力的生物防治手段之一。但目前尚缺乏理想的對土壤中外源引入的生防菌進行定位和定量的跟蹤分析方法，對病原菌與生防菌間的種群互作動態(tài)亦缺乏研究依據(jù)，這很大程度上影響了生物防治的應用。本論文以生防真苗粉紅粘帚霉67-1菌株為試材，通過對20個近緣菌株ITS區(qū)的比對分析，設計出具有種以上特異性的檢測探針，建立并優(yōu)化了針對該菌的實時熒光定量PCR檢測方法；利用該法，監(jiān)測并明確了粉紅粘帚霉與水稻紋枯

2、病菌在75天內互作菌株間種群數(shù)量的變化趨勢；初步測定了溫度和土壤含水量等環(huán)境因子對粉紅粘帚霉與水稻紋枯病菌互作的影響。所得結果如下： 粉紅粘帚霉實時熒光定量PCR檢測方法的建立與驗證：為建立植病生防真菌粉紅粘帚霉67-1菌株的熒光定量PCR檢測方法，以該菌為目標菌株，收集了包括粘帚霉、木霉在內的近緣種屬中的20個菌株，完成了所有菌株ITS區(qū)測序；以200bp的差異較大區(qū)段設計出探針和引物。其序列如下：前引物：5’-GCGTCAT

3、TTCAACCCTCAC-3’；后引物：5’-GAATATCACTACTTCGCAGAGG-3’：LNA探針：5’(FAM)-CGGGTCCGCCACTAGA-(Eclipse)3’。該引物及探針能有效擴增目標菌株，而對其他17株非目標菌株沒有擴增。另兩株種內近緣菌株的ITS區(qū)序列高度重復，亦出現(xiàn)擴增信號的結果表明，所設計的引物和探針具有種以上特異性。以目標菌株的陽性克隆質粒作為標準物質，建立標準曲線，其相關系數(shù)為0.9989；擴增效率

4、達95.0％。土壤樣品應用實驗顯示，其直線同歸相關系數(shù)為0.9989，表明所建立的土壤中粘帚霉67-1菌株熒光定量PCR檢測方法合理、有效、快速、實用，符合生態(tài)學研究的要求。 土壤中粉紅粘帚霉與水稻紋枯病菌互作的種群動態(tài)研究：將0.01％、0.1％、0.5％(w/w)的粉紅粘帚霉接種體及1％(w/w)玉米砂培養(yǎng)基中培養(yǎng)的水稻紋枯病菌接種體、殘體及菌核加入到土壤中，每15d檢測生防菌與病原菌拷貝數(shù)變化，共監(jiān)測6個周期。結果表明，在

5、不同粘帚霉添加量下，粘帚霉與水稻紋枯病菌的DNA含量在前45d均處于下降趨勢，60d時二者同時出現(xiàn)了上升。75d時，0.1％及0.5％粘帚霉添加量(w/w)的處理中，紋枯病菌的數(shù)量相對于60d降低30％左右，同時生防菌數(shù)量上升。生防菌添加量為0.1％(w/w)時，紋枯病菌數(shù)量出現(xiàn)明顯回落。因此，建議枯帚霉作為生防菌的田間施用量為0.1％(w/w)。 為深入了解溫度及含水量等環(huán)境因子對生防菌及病原菌數(shù)量的影響，將0.1％(w/w)

6、粉紅粘帚霉接種體及1％(w/w)水稻紋枯病菌接種體添加到土壤中，在不同溫度、含水量下培養(yǎng)，對粉紅粘帚霉及水稻紋枯病菌拷貝數(shù)變化進行監(jiān)測。其結果表明：在15％含水量，20℃、30℃下，粉紅粘帚霉的拷貝數(shù)在前10d急劇下降，在10～50d中，則持續(xù)增長，在50d時，15％含水量20℃下粘帚霉數(shù)量恢復到接種水平的25％；水稻紋枯病菌的拷貝數(shù)在前20d呈持續(xù)下降趨勢，在30d時出現(xiàn)短暫的數(shù)量回升，在40～50d時又回落到較低水平(5441.8±