基于免疫親合分離技術(shù)的人血漿蛋白質(zhì)組研究.pdf

1、人血液含有來源于幾乎所有細(xì)胞、組織、器官的蛋白質(zhì)，可以直接反映病理、生理狀態(tài)，是各種疾病診斷、生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)的最有價值的標(biāo)本。因此，血漿蛋白質(zhì)組成為人們研究的熱點。而血漿蛋白質(zhì)又具有獨特的性質(zhì)(蛋白質(zhì)組成、功能及結(jié)構(gòu)形式極端復(fù)雜)，高低豐度蛋白質(zhì)含量的動態(tài)范圍可差1012之巨，限制了質(zhì)譜對低豐度蛋白的有效檢測，對血漿蛋白質(zhì)組學(xué)的研究技術(shù)體系提出了挑戰(zhàn)。因此，如何去除血漿中高豐度蛋白質(zhì)從而使低豐度蛋白質(zhì)得以富集(降低高豐度蛋白質(zhì)對低豐度蛋

2、白質(zhì)鑒定的干擾)，成為血漿蛋白質(zhì)鑒定的關(guān)鍵和研究熱點。目前基于免疫親合去除血漿高豐度蛋白質(zhì)的技術(shù)得到研究者普遍認(rèn)可和廣泛的應(yīng)用，但由于血漿中幾種高豐度蛋白質(zhì)是轉(zhuǎn)運蛋白質(zhì)或結(jié)合蛋白，高豐度蛋白質(zhì)的去除可能會造成其他蛋白質(zhì)的損失，這是血漿蛋白質(zhì)組表達譜和差異蛋白質(zhì)組研究者普遍關(guān)注的問題，也是本課題研究的主要內(nèi)容；另外，對免疫親合系統(tǒng)處理樣本時造成蛋白質(zhì)非特異丟失的原因進行了考察與分析；基于兩種免疫親合分離(而非免疫親合去除)技術(shù)的血漿蛋白質(zhì)

3、組研究，使更大范圍的血漿蛋白質(zhì)鑒定得以實現(xiàn)，為今后大規(guī)模血漿蛋白質(zhì)組研究提供新的思路。 在本研究中，用目前廣泛應(yīng)用的可同時去除六種高豐度蛋白質(zhì)的免疫親合色譜柱(AgilentMARS)和剛剛發(fā)展的同時去除十二種高豐度蛋白質(zhì)的免疫親合色譜柱(GenwaySepproTMMIXEDl2)分離人血漿樣本，分別得到與親合柱結(jié)合的組分(MARS-BF和SepproTM-BF)和流出組分(MARS-FF和SepproTM-FF)。這四個蛋白

4、質(zhì)組分別經(jīng)胰蛋白酶酶切后得到復(fù)雜肽混合物，采取離線陽離子交換色譜分離及反相色譜離子阱串聯(lián)質(zhì)譜鑒定的技術(shù)體系，分別對肽混合物進行分離鑒定。采用國際人類蛋白質(zhì)組組織血漿蛋白質(zhì)組項目(HUPOPPP)推薦的過濾參數(shù)，共鑒定蛋白質(zhì)2401種，屬于較大的血漿蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)集。當(dāng)采用更嚴(yán)格的過濾參數(shù)，四個組分共鑒定蛋白質(zhì)529種，其中277種蛋白質(zhì)是HUPOPPP鑒定的889種中沒有覆蓋的。鑒定蛋白質(zhì)的動態(tài)范圍為9個數(shù)量級。采用搜索反轉(zhuǎn)數(shù)據(jù)庫的方法評

5、價數(shù)據(jù)可靠性，結(jié)果表明肽段鑒定的可靠性從73．6％上升到99％。為了確定結(jié)合組分中大量的非靶蛋白質(zhì)的存在是否是由于其和高豐度蛋白質(zhì)的相互作用造成的，對白蛋白做了免疫共沉淀實驗，并對其結(jié)合蛋白質(zhì)進行了質(zhì)譜鑒定和分析。得到40種可能與白蛋白相互作用的蛋白質(zhì)，其中24種蛋白質(zhì)與結(jié)合組分是重疊的。 免疫親合色譜處理血漿蛋白質(zhì)后，高豐度蛋白的去除降低了其對低豐度蛋白的干擾，從而有利于中、低豐度蛋白質(zhì)的鑒定。這是血漿蛋白質(zhì)成分分析鑒定的重要

6、步驟。從兩種免疫親合分離得到的結(jié)合組分來看，高豐度蛋白質(zhì)的去除會造成其他蛋白質(zhì)也隨著被去除。免疫親合技術(shù)的有效性和特異性方面有待于進一步優(yōu)化?；谑N高豐度蛋白質(zhì)的免疫親合分離與六種高豐度蛋白質(zhì)的免疫親合分離相比，并沒有鑒定更多的低豐度蛋白質(zhì)。在高可信度鑒定的529種蛋白質(zhì)中，有129種蛋白質(zhì)只存在于結(jié)合組分中，血漿免疫親合處理得到的流出組分和結(jié)合組分都進行鑒定，必然會形成互補，使血漿蛋白質(zhì)組的研究得以補充。與HUPOPPPl8個實驗