水稻葉片蛋白質(zhì)組提取、分離與富集技術(shù)的研究.pdf

1、蛋白質(zhì)組學(xué)是連接基因組學(xué)、遺傳學(xué)和生理學(xué)的一門學(xué)科，目前已成為研究生物科學(xué)各個(gè)領(lǐng)域的必不可少的學(xué)科。在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，蛋白質(zhì)的提取、分離及低豐度蛋白的富集等步驟直接影響后續(xù)的蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果。低豐度蛋白質(zhì)是植物體中重要的活性物質(zhì)，參與新陳代謝、轉(zhuǎn)錄和翻譯等多種生理及病理過(guò)程，低豐度蛋白的富集對(duì)植物蛋白質(zhì)組學(xué)的研究具有重要意義。高豐度蛋白與低豐度蛋白之間的動(dòng)態(tài)范圍可達(dá)到12個(gè)數(shù)量級(jí)，導(dǎo)致了對(duì)低豐度蛋白質(zhì)檢測(cè)困難。組合肽配體庫(kù)技術(shù)是一種新型

2、的富集低豐度蛋白的方法，能夠?qū)崿F(xiàn)在降低高豐度蛋白質(zhì)豐度的同時(shí)富集低豐度蛋白質(zhì)，目前已被應(yīng)用于各領(lǐng)域的蛋白質(zhì)組學(xué)研究中。本論文對(duì)水稻葉片蛋白質(zhì)組提取、分離與富集技術(shù)進(jìn)行研究，為水稻蛋白質(zhì)組研究提供了技術(shù)支撐，為深入研究水稻蛋白質(zhì)組提供了理論基礎(chǔ)。
　　1、確立了酚法提取、二維液相色譜分離水稻葉片蛋白質(zhì)組的方法。此提取方法為后續(xù)蛋白質(zhì)的富集研究提供了技術(shù)支撐。比較了水稻葉片蛋白質(zhì)提取方法（酚法、十二烷基硫酸鈉法(SDS法)和三氯乙酸／

3、丙酮法(TCA/丙酮法)）、液相色譜分離系統(tǒng)（一維液相色譜與二維液相色譜）對(duì)蛋白質(zhì)鑒定數(shù)量的影響。結(jié)果表明:二維液相色譜條件下，酚法、SDS法和TCA/丙酮法鑒定的蛋白質(zhì)數(shù)目為2712、2415和1914，分別是一維液相色譜條件下鑒定到的蛋白質(zhì)數(shù)目的2.7、2.5和1.9倍。與SDS法和TCA/丙酮沉淀法相比，酚法不但鑒定到的蛋白質(zhì)數(shù)量多，而且能夠鑒定到一些極端蛋白質(zhì)。此外，對(duì)二維液相色譜條件下3種蛋白質(zhì)提取方法提取的蛋白質(zhì)進(jìn)行分類發(fā)現(xiàn)

4、3種方法鑒定到的蛋白質(zhì)的功能存在互補(bǔ)性。本方法為水稻蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供了技術(shù)支撐，同時(shí)也為其他作物的蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)提供重要的借鑒。
　　2、利用組合肽配體庫(kù)技術(shù)富集水稻葉片中的低豐度蛋白質(zhì)，并對(duì)該方法適用于水稻葉片蛋白質(zhì)富集過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化。通過(guò)考察三種緩沖液pH(pH7的Tris緩沖溶液、pH9的Tris緩沖溶液和pH4的醋酸鹽緩沖溶液)、三種洗脫液（8mol/L尿素/2％CHAPS/5％乙酸、煮沸的4％SDS/50mmol/L

5、 DTT和9mol/L尿素/5％乙酸）對(duì)組合肽配體庫(kù)技術(shù)富集效率的影響，明確了對(duì)于水稻葉片蛋白質(zhì)，組合肽配體庫(kù)技術(shù)在pH7和pH9有較好的富集效果，且鑒定到的粗蛋白與不同pH組分中的蛋白質(zhì)存在互補(bǔ)性。此外，8mol/L尿素/2％CHAPS/5％乙酸對(duì)蛋白質(zhì)的洗脫最徹底。本方法為CPLL技術(shù)應(yīng)用于植物蛋白質(zhì)組學(xué)研究以及低豐度蛋白質(zhì)的分離純化提供技術(shù)支持。
　　3、研究了不同鎘濃度處理后鑒定到的水稻葉片蛋白質(zhì)組的表達(dá)差異。對(duì)照組、鎘離