RAMP1促進(jìn)CRLR膜分布對CGRP抑制VSMCs增殖的研究.pdf

1、目的：觀察過表達(dá)RAMP1對CGRP抑制AngII誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響；探討過表達(dá)RAMP1對細(xì)胞中CRLR表達(dá)和分布的關(guān)系。
　　方法：1、pCDNA3.1(+)-RAMP1真核表達(dá)載體的構(gòu)建：從A10細(xì)胞中提取總RNA，進(jìn)行RT-PCR后獲得RAMP1的開放閱讀框（ORF），將RAM1 ORF和pCDNA3.1(+)載體分別用EcoRI/BamHI雙酶切后連接轉(zhuǎn)化DH5α，經(jīng)測序正確后提重組質(zhì)粒備用。2、穩(wěn)定細(xì)胞系的

2、建立：用不同濃度的G418培養(yǎng)基培養(yǎng) A10細(xì)胞，以14天殺死全部A10細(xì)胞的G418濃度為A10細(xì)胞的篩選濃度。優(yōu)化轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)粒的比例，按標(biāo)準(zhǔn)程序轉(zhuǎn)染細(xì)胞；轉(zhuǎn)染48小時候后用 G418的培養(yǎng)基篩選陽性克隆，經(jīng)RT-PCR和Western-blot鑒定后將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗。3、用0.1％FBS同步化24小時，100nM CGRP或（和）100 nM AngII作為處理因素處理未轉(zhuǎn)染組（No plasmid）、空載體組（pCD

3、NA3.1（+））、過表達(dá)組（pCDNA3.1（+）-RAMP1）細(xì)胞，噻唑藍(lán)比色（MTT）觀察細(xì)胞增殖的情況；用 RT-PCR法和蛋白免疫印跡法檢測CRLR的表達(dá)情況；用免疫熒光法檢測RAMP1和CRLR的膜分布情況。
　　結(jié)果：1、將RAMP1基因的ORF克隆進(jìn)pCDNA3.1(+)載體，重組子經(jīng)EcoRI/BamHI雙酶切和測序鑒定，成功構(gòu)建 pCDNA3.1(+)-RAMP1真核表達(dá)載體；2、MTT結(jié)果顯示用CGRP預(yù)孵育

4、30min，過表達(dá)組細(xì)胞OD570值低于非轉(zhuǎn)染組和空載體組；RT PCR法檢測各組的CRLR mRNA水平，結(jié)果顯示各組細(xì)胞中的CRLR mRNA水平?jīng)]統(tǒng)計學(xué)意義；Western blot法檢測各組的CRLR蛋白水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在聯(lián)合加入CGRP和AngII因素處理后，過表達(dá)組的CRLR蛋白水平低于未轉(zhuǎn)染組和空載體組，單獨(dú)用CGRP因素處理后，過表達(dá)組的CRLR蛋白水平高于未轉(zhuǎn)染組和空載體組，而使用0.1%FBS或AngII處理后，三種細(xì)