大黃化學組分的提取分離及其對腎小球系膜細胞增殖的抑制作用.pdf

1、文章主要從以下幾方面進行了論述。
　　第一部分藥學研究。
　　目的：提取分離大黃化學組分。
　　方法：采用6種型號的大孔樹脂(D101、X-5、AB-8、DM301、DM130、DA201)對大黃化學組分進行分離，以大黃酸與大黃素含量作為指標成分，用高效液相色譜(HPLC)檢測分析其分離效果。
　　結果：各型號的大孔樹脂分離大黃酸與大黃素的得率D101(0.2796％;0.1359％)、X-5(0.6947％;0

2、.2190％)、AB-8(0.6458％;0.3206％)、DM301(0.5839％;0.1297％)、DM130(0.7202％;0.3408％)、DA201(0.4622％;0.2337％)，其中DM130得率最高，經(jīng)HPLC分析，30％、60％洗脫組成分未知，90％洗脫組為大黃游離葸醌，其主要化合物為大黃酸、大黃素、蘆薈大黃素，純度為90％。
　　結論：經(jīng)DM130分離得到的90％乙醇洗脫組為大黃游離蒽醌，其主要成分為大黃

3、酸、大黃素、蘆薈大黃素，純度為90％，符合藥用標準。
　　第二部分藥理學研究。
　　目的：
　　1.模型建立:分別用高糖(30 mmol/L)及正常葡萄糖(5.56 mmol/L)培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細胞(mesangial cell，MC)，觀察其對MC增殖的影響，建立高糖狀態(tài)下MC增殖病理模型。
　　2.大黃活性組分篩選:分別用30％、60％組分及游離蒽醌刺激高糖培養(yǎng)下的MC，觀察其對MC增殖的影響，篩選出大黃

4、中的活性組分。
　　3.探討大黃游離蒽醌對高糖培養(yǎng)下MC中相關基因表達的調控作用及基質蛋白分泌的影響，探討其作用機制。
　　方法：
　　1.大黃活性組分篩選
　　將經(jīng)傳代的MC同步化后分組:NG組（5.56 mmol/L葡萄糖）、MA組(5.56mmol/L葡萄糖+24.44 mmol/L甘露醇)、HG組（30 mmol/L葡萄糖）、RM組(30mmol/L葡萄糖+1‰ DMSO)、30G組(0.25、0.5、1

5、、5、10、20、40μg/ml+30 mmol/L葡萄糖+1‰ DMSO)、60G組(0.25、0.5、1、5、10、20、40μg/ml+30 mmol/L葡萄糖+1‰DMSO)、FARG組(0.25、0.5、1、5、10、20、40μg/ml+30 mmol/L葡萄糖+1‰DMSO)，刺激12h、24h、48 h，采用CCK-8法，用酶標儀于450 nm波長測定OD值。
　　2.大黃游離蒽醌對MC相關基因表達的調控作用及基質

6、蛋白分泌的影響
　　將經(jīng)傳代的MC同步化后分組:NG組（5.56 mmol/L葡萄糖）、MA組(5.56mmol/L葡萄糖+24.44 mmol/L甘露醇)、HG組(30 mmol/L葡萄糖)、RM組(30mmol/L葡萄糖+1‰DMSO)、FARL組（5μg/ml+30 mmol/L葡萄糖+1‰DMSO）、FARM組（10μg/ml+30 mmol/L葡萄糖+1‰DMSO）、FARH組（20μg/ml+30mmol/L葡萄糖+1

7、‰DMSO），刺激12h、24 h、48 h，RT-PCR法檢測MC中TGF-β1、CTGF、ⅣCol和FN mRNA表達;ELISA法檢測MC上清中TGF-β1、CTGF、ⅣCol和LN的蛋白含量。
　　結果：
　　1.大黃活性組分的篩選
　　1.1模型建立:與NG組比較，HG組OD值明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　1.2與Rm組比較，HG組OD值無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

8、
　　1.3與HG組比較，12h，30G組、60G組、FARG組OD值明顯下降，隨著時間延長，OD值下降更加顯著，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，其中，30G組和60G組在48h，20μg/ml時OD值明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，而FARG組在48 h，5μg/ml時OD值明顯下降，且隨著劑量的增加，OD值下降愈顯著，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　2.大黃游離蒽醌對MC中TGF-β1、CTGF、Ⅳ

9、 Col、FN基因表達的調控作用及TGF-β1、CTGF、ⅣCol、LN蛋白分泌的影響
　　2.1模型建立:與NG組比較，HG組MC中TGF-β1、CTGF、ⅣCol、FN的、基因表達及TGF-β1、CTGF、ⅣCol、LN蛋白分泌明顯上升，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　2.2對MC中TGF-β1、CTGF、ⅣCol、FN基因表達的調控作用:
　　與RM組比較，HG組MC中TGF-β1、CTGF、ⅣCol、F

10、N的基因表達，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　與HG組比較，12h，F(xiàn)AR各組MC中TGF-β1基因表達有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);24 h，F(xiàn)ARM、FARH組MC中TGF-β1基因表達下降，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);48 h，F(xiàn)AR各組MC中TGF-β1基因表達下降，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。12h，F(xiàn)ARM、FARH組MC中CTGF基因表達下降，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);2

11、4h，F(xiàn)AR各組MC中CTGF基因表達均下降，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);48h，F(xiàn)ARH組MC中CTGF基因表達下降，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。12h，24 h，48 h，F(xiàn)AR各組MC中Ⅳ Col基因表達均下降，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。12h，F(xiàn)ARM、FARH組MC中FN基因表達明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);24h，F(xiàn)ARH組MC中FN基因表達明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);48h

12、，F(xiàn)AR各組MC中FN基因表達明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　3.對MC中TGF-β1、CTGF、ⅣCol、LN基質蛋白分泌的影響
　　與RM組比較，HG組中MC中TGF-β1、CTGF、ⅣCol、LN基質蛋白的分泌，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　與HG組比較，12h，F(xiàn)AR各組MC中TGF-β1蛋白分泌有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);24h，F(xiàn)AR各組MC中TGF-β1基質

13、蛋白分泌下降，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);48h，F(xiàn)ARM、FARH組MC中TGF-β1蛋白分泌降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。12h、24h，F(xiàn)AR各組MC中CTGF蛋白分泌均下降，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);48h，F(xiàn)AR各組MC中CTGF蛋白分泌有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。12h，F(xiàn)ARH組MC中ⅣCol蛋白分泌降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);24h，F(xiàn)ARM、FARH組MC中ⅣCo

14、l蛋白分泌降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);48h，F(xiàn)AR各組MC中ⅣCol蛋白分泌無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。12h，F(xiàn)ARM組MC中LN蛋白分泌均下降，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);24h，F(xiàn)ARL、FARM組MC中LN蛋白分泌均下降，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);48h，F(xiàn)AR各組MC中LN蛋白分泌有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　結論：
　　1.大黃活性組分篩選

15、r>　　1.1高糖能顯著地促進了MC增生，說明MC增殖模型符合實驗要求。
　　1.230％、60％組分、游離蒽醌均能抑制高糖培養(yǎng)的MC增殖，但是大黃游離蒽醌的作用優(yōu)于其它兩組，且表現(xiàn)出一定的劑量和時間依賴性，因此，篩選出大黃游離蒽醌的劑量組:5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml，進一步研究其對MC基質分泌的影響。
　　2.大黃游離蒽醌對MC基質分泌的影響
　　2.1與NG組比較，HG組MC中TGF-β1、CTG

16、F、Ⅳ Col、FN基因表達及TGF-β1、CTGF、Ⅳ Col、LN蛋白分泌明顯升高，說明高糖可刺激MC細胞外基質的分泌。
　　2.2與RM組比較，HG組MC中TGF-β1、CTGF、ⅣCol、FN基因表達及TGF-β1、CTGF、Ⅳ Col、LN蛋白分泌無顯著性差異，提示DMSO對實驗結果無影響。
　　2.3在20μg/ml，24 h時，大黃游離蒽醌能顯著抑制TGF-β1、CTGF、ⅣCol、FN的基因表達及TGF-β1