RNAi沉默Notch1基因?qū)Χ喟l(fā)性骨髓瘤細(xì)胞致瘤性影響及機(jī)制研究.pdf

1、目的:通過RNA干擾技術(shù)，靶向沉默人多發(fā)性骨髓瘤RPMI8226細(xì)胞Notch1基因，評估Notch1表達(dá)下調(diào)后對多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞增殖、凋亡，相關(guān)蛋白Hes-1、Jagged-1、Jagged-2及Bcl-2、PTEN/PI3K/AKT信號通路的影響，進(jìn)一步探討Notch1在多發(fā)性骨髓瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及分子機(jī)制，為尋找新的骨髓瘤治療靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:構(gòu)建靶向沉默Notch1基因的shRNA表達(dá)載體pGshRNA-

2、Notch1，轉(zhuǎn)染入人多發(fā)性骨髓瘤RPMI8226細(xì)胞，G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞。實(shí)時(shí)熒光定量PCR及Western blot法檢測轉(zhuǎn)染后Notch1 mRNA和蛋白表達(dá)的變化。CCK-8法、流式細(xì)胞儀檢測瘤細(xì)胞體外增殖、凋亡的變化。建立NOD/SCID小鼠多發(fā)性骨髓瘤模型，通過觀察成瘤時(shí)間、大小以及ELISA法檢測血清中分泌IL-6、VEGF水平以研究Notch1基因沉默對致瘤性的影響。運(yùn)用Western blot法檢測Notch1信

3、號通路相關(guān)蛋白Hes-1、Jegged-1、Jegged-2、Bcl-2、PTEN、AKT、p-AKT的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果:篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞，實(shí)時(shí)熒光定量PCR及Western blot法檢測Notch1 mRNA和蛋白表達(dá)的變化，實(shí)驗(yàn)組相對于陰性對照組表達(dá)量明顯下調(diào)(P＜0.05)。CCK-8法及流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的增殖活力明顯低于陰性對照組(P＜0.05)，且對細(xì)胞凋亡有明顯促進(jìn)作用(P＜0.05)。動

4、物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Notch1沉默細(xì)胞皮下成瘤體積小，血清中分泌IL-6和VEGF較陰性對照組減少(P＜0.05)。實(shí)驗(yàn)組Jegged-1、Jegged-2和AKT蛋白表達(dá)水平與對照組相比無明顯變化，而下游蛋白Hes-1、Bcl-2、p-AKT明顯下調(diào)，PTEN明顯上調(diào)。
　　 結(jié)論:1.沉默Notch1基因可抑制骨髓瘤RPMI8226細(xì)胞體內(nèi)外增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，明顯減低骨髓瘤細(xì)胞的致瘤性;2.作用機(jī)制可能與下調(diào)下游蛋白Hes-1