FRET對(duì)活體細(xì)胞內(nèi)APP裂解過程的動(dòng)態(tài)研究.pdf

1、目的：
　　 構(gòu)建含有突變型APP的熒光真核表達(dá)系統(tǒng)以研究APP的酶解過程和Aβ產(chǎn)生的分子機(jī)制。
　　 方法：
　　 以質(zhì)粒pcDNA3.0-CFP-CaM-YFP的BglII酶切產(chǎn)物為模板，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)分別得到編碼藍(lán)色熒光蛋白(cyan fluorescence protein，CFP)和黃色熒光蛋白堿基序列(yellow fluorescence protein,YFP)；以pcDNA3.0-

2、APP為模板，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)得到含有APP717突變的最后300堿基片段(C99)；生物合成含有Swedish突變的APP中間54個(gè)堿基片段(54bp)。利用基因工程技術(shù)將CFP、54bp、YFP、C99片段克隆至載體質(zhì)粒pcDNA3.0中，得到重組質(zhì)粒pcDNA3.0-CFP-54bp-YFP-C99和pcDNA3.0-CFP-54bp-YFP，酶切和測序鑒定。將構(gòu)建的融合基因轉(zhuǎn)染至SH-SY5Y細(xì)胞中，通過RT-PCR

3、檢測融合基因mRNA表達(dá)，利用多光子共聚焦顯微鏡觀察不同時(shí)間點(diǎn)(12h、24h、48h、72h、96h)轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)的熒光蛋白表達(dá)情況。細(xì)胞轉(zhuǎn)染12h、18h、24h、36h、48h、72h后，檢測FRET，予以波長為820nm的CFP激發(fā)光激發(fā)，采集發(fā)射波長為473nm的CFP圖像，同時(shí)采集發(fā)射波長為525nm的YFP圖像；計(jì)算CFP、YFP熒光強(qiáng)度(ICFP和IYFP)和兩者的比率(Fret=IYFP/ICFP)，繪制曲線。pcDNA

4、3.0-CFP-54bp-YFP-C99轉(zhuǎn)染細(xì)胞48h后，利用多光子共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)黃色熒光蛋白的表達(dá)、分布以及YFP標(biāo)記的Aβ去向。免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定Aβ的生成。pcDNA3.0-CFP-54bp-YFP-C99、pcDNA3.0-CFP-54bp-YFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞12h、24h、36h、48h、72h、96h后，MTT檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞活性，了解Aβ對(duì)細(xì)胞的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1、CFP、YFP、C99的PCR產(chǎn)

5、物大小分別為818bp、738bp、325bp，經(jīng)過不同的雙酶切得到的酶切產(chǎn)物大小分別為702bp、723bp和310bp，電泳證實(shí)與預(yù)期一致；重組質(zhì)粒pcDNA3.0-CFP-54bp-YFP-C99、pcDNA3.0-CFP-54bp-YFP分別經(jīng)過不同的組合酶切，得到的目的片段長度正確；測序鑒定證明融合基因CFP-54bp-YFP-C99、CFP-54bp-YFP的序列與“gene bank”的堿基信息相符。
　　 2、將

6、轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行RT-PCR顯示有目的片段，分別對(duì)應(yīng)于CFP-54bp-YFP-C99和YFP-C99，對(duì)照細(xì)胞內(nèi)則無相應(yīng)片段。
　　 3、轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)有藍(lán)色(和)黃色熒光表達(dá)，在轉(zhuǎn)染12h后已經(jīng)可以觀察到細(xì)胞內(nèi)有熒光分布，24h熒光逐漸增多，至48h熒光進(jìn)一步增多增強(qiáng)，72h熒光有所減少，96h熒光明顯減少減弱。
　　 4、pcDNA3.0-CFP-54bp-YFP細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后始終存在FRET，細(xì)胞輪廓光滑；pcDNA3.0

7、-CFP-54bp-YFP-C99細(xì)胞在轉(zhuǎn)染12h后有微弱FRET，以后無FRET，細(xì)胞內(nèi)有顆粒廣泛沉積。
　　 5、CFP-54bp-YFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞Fret不變；CFP-54bp-YFP-C99轉(zhuǎn)染細(xì)胞Fret下降。
　　 6、CFP-54bp-YFP-C99在轉(zhuǎn)染細(xì)胞48h后，能夠被β、γ分泌酶裂解產(chǎn)生Aβ。
　　 7、Aβ產(chǎn)生于首先細(xì)胞內(nèi)，聚集成顆粒，廣泛分布于細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞膜上，細(xì)胞外間隙也有少量分布，但沒

8、有形成明顯沉積。
　　 8、Aβ形成后細(xì)胞形態(tài)異常。
　　 9、免疫細(xì)胞化學(xué)進(jìn)一步證實(shí)Aβ的生成。
　　 10、MTT證實(shí)細(xì)胞內(nèi)聚集的Aβ使得細(xì)胞活性下降，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：
　　 1、熒光標(biāo)記并含有Swedish(和APP717)突變的重組質(zhì)粒pcDNA3.0-CFP-54bp-YFP-C99和pcDNA3.0-CFP-54bp-YFP構(gòu)建成功。
　　 2、融合

9、基因在mRNA和蛋白水平均能夠正確表達(dá)，為下一步研究APP裂解和Aβ產(chǎn)生提供了一種有力工具。
　　 3、FRET能夠敏感準(zhǔn)確的檢測APP有無發(fā)生β裂解。
　　 4、CFP-54bp-YFP-C99能夠被β分泌酶裂解而CFP-54bp-YFP不能被裂解，提示C99可能起到信號(hào)肽樣的引導(dǎo)定位作用，對(duì)β分泌酶裂解APP具有重要意義；干擾C99可能會(huì)抑制Aβ的產(chǎn)生，本實(shí)驗(yàn)為探索AD的早期干預(yù)提供一種新思路。
　　 5、融