人痘苗病毒H相關磷酸酯酶VHR小分子抑制劑的發(fā)現(xiàn).pdf

1、人痘苗病毒H1相關磷酸酯酶(Human vaccinia H1-related phosphatase，VHR)是非典型的雙位點特異性磷酸酯酶(dual-specificity phosphatase，DSPs)家族中的一員。VHR僅有催化結構域，是研究DSPs結構與功能的理想模型。它對有絲分裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)家族成員胞外信號調(diào)控激酶(extracellula

2、r signal-regulated kinases，ERK)和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinases，JNK)進行去磷酸化，是MAPK信號轉導途徑的負調(diào)節(jié)者。最近研究發(fā)現(xiàn)，VHR在眾多的腫瘤細胞株中高表達，并且通過負調(diào)控MAPK信號通路，在腫瘤細胞的生長、分化及衰老方面起到重要作用，VHR因此成為潛在的藥物作用靶分子。 我們從原核大腸桿菌系統(tǒng)中成功表達并純化得到VHR重組蛋白，通過對VHR的一

3、系列酶學特性，包括DTT、EDTA和鹽離子濃度的影響、pH依賴性、動力學分析及陽性抑制劑(Na<,3>VO<,4>)抑制作用分析，并優(yōu)化VHR的活性檢測方法，建立了VHR的高通量篩選(high throughput screening，HTS)模型。通過對國家化合物樣品庫中的65760個樣品進行篩選，得到了34個抑制活性較好的化合物，其IC<,50>均低于3μg/mL。其中活性化合物Comp 1的IC<,50>為1.20μM，為結構新穎

4、的VHR小分子抑制劑。通過分子水平酶動力學方法對其抑制性質(zhì)進行研究，發(fā)現(xiàn)該化合物為可逆的、非競爭型VHR抑制劑。通過檢測Comp 1對其它蛋白酪氨酸磷酸酯酶(Protein tyrosine phosphatases，PTPs)的選擇性，發(fā)現(xiàn)Comp 1對經(jīng)典跨膜受體型PTPs，如白細胞共同抗原(leukocyte common antigen，LCA or CD45)和白細胞共同抗原相關蛋白(leukocyte common anti

5、gen-related protein，LAR)，對經(jīng)典胞內(nèi)非受體型PTPs，包括蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B(Protein Tyrosine Phosphatase 1B)和含有SH2結構域的蛋白酪氨酸磷酸酯酶1(SH-2 domain containing tyrosinephosphase 1，SHP1)，對同屬于雙位點特異性磷酸酯酶亞家族的細胞分裂周期25同源物A(cell division cycle 25 homolog A，C

6、DC25A)均具有較高的選擇性，表現(xiàn)出極低的抑制活性；而對含有SH2結構域的蛋白酪氨酸磷酸酶2(SH-2 domain containing tyrosine phosphase 2，SHP2)和細胞分裂周期25同源物B(cell division cycle 25 homolog B，CDC25B)具有一定的選擇性，表現(xiàn)出較強的抑制活性。 另外，我們對Comp 1細胞水平的生物活性進行了評價，發(fā)現(xiàn)Comp 1能提高宮頸癌細胞系

7、Hela細胞中ERK和JNK的磷酸化水平，并能抑制宮頸癌細胞系HeLa、結腸癌細胞系HT-29、乳腺癌細胞系MDA-MB-435S的生長。高劑量的Comp 1可誘導HeLa細胞周期阻滯在G2/M期，并誘導出現(xiàn)明顯的細胞凋亡。 這一高活性、高選擇性的新型小分子VHR抑制劑的發(fā)現(xiàn)、相關抑制性質(zhì)的研究以及在細胞水平的生物活性評價，為其進一步結構優(yōu)化和藥理學、藥效學研究打下堅實的基礎，這對于進一步理解選擇性所依存的分子機制及尋找高效特異