電針預處理改善心肌缺血性損傷的β-,1--腎上腺素能受體信號轉(zhuǎn)導機制.pdf

1、心肌缺血性疾病是世界范圍內(nèi)死亡率最高的疾病之一。過去的臨床和實驗工作表明，針刺可以改善心肌缺血引起的心電圖ST段的改變，緩解心絞痛。但由于心肌缺血性疾病(如冠心病等)發(fā)病兇險，死亡率較高，一般急性發(fā)作病人很少來針灸科治療，使得針灸在該病的治療上難以發(fā)揮作用。然而，過去有關(guān)針灸方面的研究工作卻提示，針灸可能對于冠心病、心肌缺血具有未病先防的作用，即，預防或減輕冠心病的發(fā)病。因此，探討一條合適的途徑來發(fā)揮針刺在防治冠心病心肌缺血性損害的作用

2、具有重要的臨床意義和科學價值。 大量研究證實：心肌缺血性損害可以引發(fā)心臟交感神經(jīng)過度興奮以及心臟對交感神經(jīng)興奮性調(diào)節(jié)的反應性增強。繼而引起β1-腎上腺素能受體(β1-AR)過度興奮，經(jīng)一系列信號轉(zhuǎn)導機制，最終導致心肌細胞內(nèi)鈣超載等因素有關(guān)。而適當提高交感神經(jīng)興奮性對心肌缺血具有保護作用，如采用心臟腎上腺素能受體及其信號轉(zhuǎn)導成分激動劑預處理方法，可以改善其后較長時間的心肌缺血導致的心肌損傷。而過去有關(guān)針灸方面的研究工作顯示，針刺可

3、直接提高交感神經(jīng)的興奮性。因此，針刺極有可能通過影響交感神經(jīng)系統(tǒng)，進而作用于心臟β1-AR及其受體后的信號轉(zhuǎn)導通路，從而象受體激動劑預處理一樣，起到改善缺血性心肌損害的作用。然而，迄今這方面的研究工作尚未見報道。 本項研究采用結(jié)扎和再灌大鼠左冠狀動脈前降支的方法建立實驗性心肌局部缺血模型和離體心臟模擬全心缺血(低灌流)模型，探討電針預處理對心肌缺血性損傷的保護作用，并深入闡明β1-AR及其受體后信號轉(zhuǎn)導路徑在介導電針預處理改善缺

4、血性心肌損害中的作用。為針刺預防冠心病、心肌缺血及針刺的“治未病”的保健作用提供現(xiàn)代科學基礎。 實驗選用雄性成年Wister大鼠120只，體重278±25g；雄性成年Sprague-Dawley(SD)大鼠60只，體重255±17g。第一部分實驗中將大鼠隨機分為四組：正常對照組(NC組)、缺血再灌注組(IR組)、缺血再灌注+電針組(EA組)和缺血再灌注+電針+心得安組(EAP組)。EA組于每次麻醉后電針內(nèi)關(guān)30min(電針參數(shù)：

5、強度5mA，頻率20Hz)，連續(xù)三天；EAP組于每次麻醉后先腹腔注射心得安(10mg/kg)，15min后再電針內(nèi)關(guān)30min，連續(xù)三天。NC組、IR組僅于每次麻醉后捆綁30min，不做其他處理，連續(xù)三天。第二部分實驗中將大鼠隨機分為三組：NC組、IR組和EA組，各組預處理方法同前。 實驗共分兩部分進行：第一部分實驗通過觀察心電圖ST段變化、心律失常評分、心肌梗塞范圍測定、分離的心肌細胞存活率以及異丙腎上腺素(Isoproter

6、enol，ISO)作用下單個心肌細胞內(nèi)鈣振蕩([Ca2+]ioscillation)情況等指標來確定電針預處理的保護作用。第二部分實驗通過觀察β1-AR蛋白、Gsα蛋白、cAMP的變化，以及Forskolin(腺苷酸環(huán)化酶的激動劑)、8-Br-cAMP(蛋白激酶A的激動劑)、BayK-8644(L-型Ca2+通道的激動劑)等β1-AR信號轉(zhuǎn)導成分激動劑的作用下，單個心肌細胞內(nèi)游離Ca2+變化情況，探討β1-AR及其受體后的信號轉(zhuǎn)導通路上

7、哪一或哪些信號分子參與介導電針預處理改善心肌缺血的保護作用。具體結(jié)果如下： 1.電針預處理改善心肌缺血性損傷療效的確定1)心電圖(ECG)ST段變化：結(jié)扎前NC，IR，EA和EAP組分別為：42.80±8.43，43.35±10.78，35.97±4.62和44.88±11.58μV，缺血期各組動物(NC組除外)的ST段均呈進行性抬高，至結(jié)扎30min到達峰值，IR，EA，EAP組分別為162.50±30.24，103.00±1

8、5.98和142.38±24.39μV，與正常組43.50±9.67μV比較，IR組ST段顯著抬高(P＜0.01)，而與IR組比較，EA組ST段抬高幅度明顯降低(P＜0.01)；各組再灌注10min后三組ST段均有不同程度的回落，IR組為：110.50±23.82μV，明顯高于正常組44.19±10.55μV(P＜0.01)，僅有EA組逐步恢復至結(jié)扎前水平，為50.81±10.27μV，與IR組比較其抬高幅度明顯降低(P＜0.01)；而

9、EAP組于結(jié)扎30min142.38±24.39μV和再灌注10min93.19±19.21μV，其抬高幅度與IR組很接近，均明顯高于EA組(P值均＜0.01)。 2)心律失常評分：IR組評分為3.17±1.17，明顯高于NC組(P＜0.01)；EA組評分為1.10±0.99，明顯低于IR組(P＜0.01)；EAP組心律失常評分為2.97±0.99，明顯高于EA組(P＜0.01)。 3)梗塞范圍測定：IR組梗塞范圍為38

10、.63±2.92﹪，EA組為21.51±1.73﹪，明顯低于與IR組(P＜0.01)；而EAP組為36.62±3.70﹪，與IR組很接近，而明顯高于EA組(P＜0.01)。4)心肌細胞存活率：NC組心肌細胞存活率為73.53±0.86﹪；而IR組存活率為22.80±0.78﹪，明顯低于NC組(P＜0.01)；EA組為71.62±0.46﹪，明顯高于IR組(P＜0.01)；而EAP組為24.41±0.67﹪，明顯高于EA組(P＜0.01)

11、 5)Isoproterenol(ISO)誘發(fā)的鈣振蕩：IR組心肌細胞在加入ISO(1×10-6mol/L)后出現(xiàn)了頻繁的鈣振蕩；EA組心肌細胞在ISO作用下鈣振蕩的發(fā)生明顯降低；而EAP組心肌細胞卻在加入ISO后亦出現(xiàn)了頻繁的鈣振蕩。 2.探討β1-AR及其信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)在電針預處理改善心肌缺血性損傷中的介導作用1)β1-AR蛋白變化：IR組β1-AR蛋白與NC組比較增加了40.78﹪(P＜0.01)，而EA組增加了11

12、.93﹪，明顯低于IR組(P＜0.01)。 2)Gsα蛋白變化：IR組Gsα-S和Gsα-L蛋白與NC組比較分別增加了37.86﹪(P＜0.01)和25.58﹪(P＜0.01)，而EA組僅分別增加了0.59﹪和1.92﹪，但均明顯低于IR組(P＜0.01和P＜0.05)。 3)Forskolin作用下心肌細胞內(nèi)鈣瞬變情況：IR組缺血心肌細胞在Forskolin(5×10-7mol/L)激動下鈣瞬變的波幅與Control相

13、比較增加了157.87﹪(P＜0.01)，與相應的NC組增加的幅度(77.07﹪)比較明顯增高(P＜0.01)，而EA組缺血心肌細胞在Forskolin作用下鈣瞬變的增加的幅度為78.41﹪(P＜0.01)，與相應的IR組比較增加幅度明顯降低(P＜0.01)。 4)心肌組織cAMP含量：NC組為0.36±0.07pmol/mL，而IR組為0.62±0.09pmol/mL，明顯高于NC組(P＜0.01)，EA組為0.36±0.05

14、pmol/mL，其含量明顯低于與IR組(P＜0.01)。 5)8-Br-cAMP作用下心肌細胞內(nèi)鈣瞬變情況：IR組缺血心肌細胞在8-Br-cAMP(1×10-6mol/L)激動下鈣瞬變的波幅與Control相比較增加了68.92﹪(P＜0.01)，與相應的NC組增加的幅度(54.15﹪)比較明顯增高(P＜0.01)，而EA組缺血心肌細胞在8-Br-cAMP作用下鈣瞬變的增加的幅度為57.36﹪(P＜0.01)，與相應的IR組比較

15、增加幅度明顯降低(P＜0.05)。 6)BayK-8644作用下心肌細胞內(nèi)鈣瞬變情況：IR組缺血心肌細胞在BayK-8644(5×10-7mol/L)激動下鈣瞬變的波幅與Control相比較增加了78.02﹪(P＜0.01)，與相應的NC組增加的幅度(59.06﹪)比較明顯增高(P＜0.01)，而EA組缺血心肌細胞在BayK-8644作用下鈣瞬變的增加的幅度為62.17﹪(P＜0.01)，與相應的IR組比較增加幅度明顯降低(P＜

16、0.01)。 結(jié)論大鼠局部心肌缺血可造成ST段的過度抬高、心律失常發(fā)生率及心肌梗塞面積的異常增加；模擬全心缺血后，心肌細胞的存活率大大降低、并且導致ISO誘導的鈣振蕩現(xiàn)象頻發(fā)。由本實驗觀察結(jié)果提示其損害機制表現(xiàn)為：缺血心肌細胞膜內(nèi)β1-AR蛋白水平的異常增高，從而沿其信號轉(zhuǎn)導路徑引起Gsα蛋白水平和缺血心肌組織cAMP含量的過度增高，并導致心肌細胞對Forskolin(AC激動劑)、8-Br-cAMP(PKA激動劑)和BayK-

17、8644(L-型Ca2+通道激動劑)作用下引起的細胞內(nèi)游離鈣變化的反應性均明顯增強等一系列變化?？梢姦?-AR信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)各個站點：β1-AR、Gsα、AC、cAMP、PKA和L-型Ca2+通道都參與介導了心肌缺血誘導的心肌損害和心臟功能障礙。 電針預處理可以有效地減低大鼠心肌缺血所引起的ST段的抬高；降低心肌梗塞面積；提高缺血心肌細胞的存活率；減少缺血性心臟心律失常的發(fā)生率；抑制缺血心肌細胞由ISO誘導的鈣振蕩，對隨后的心肌缺