mCRT-sPD1嵌合基因的融合蛋白用于抗腫瘤免疫治療的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：腫瘤的免疫逃逸是腫瘤得以發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵因素,其中腫瘤誘導(dǎo)大量的免疫抑制分子構(gòu)成的信號(hào)通路有效的抑制了免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤組織的殺傷效應(yīng)。本研究主要設(shè)計(jì)并表達(dá)小鼠鈣網(wǎng)蛋白(Calreticulin,CRT)與可溶性程序性死亡受體1(programmed cell death1)胞外段的融合蛋白 CRT-sPD1,并論證融合蛋白阻斷PD1/PDL1信號(hào)通路并靶向的將具有促進(jìn)抗原提呈的CRT攜帶到腫瘤分子表面誘導(dǎo)特異性抗腫瘤免疫應(yīng)答,介導(dǎo)免

2、疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤的殺傷和清除作用。
　　方法:(1)利用PCR技術(shù)從小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的cDNA中獲取截短的CRT和PD1的目的基因并構(gòu)建pcDNA3.1(+)/CRT、pcDNA3.1(+)/PD1、pcDNA3.1(+)/CRT-sPD1真核表達(dá)質(zhì)粒。(2)將pcDNA3.1(+)/CRT、pcDNA3.1(+)/PD1、pcDNA3.1(+)/CRT-sPD1和pcDNA3.1(+)(陰性對(duì)照)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染B16-F1細(xì)胞,通過(guò)G41

3、8篩選后,挑取陽(yáng)性克隆擴(kuò)大培養(yǎng),western blot鑒定CRT、PD1、CRT-sPD1在B16-F1細(xì)胞中表達(dá),并利用ELISA法和流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)融合蛋白分泌到細(xì)胞上清中,并能與EL4細(xì)胞膜上高表達(dá)的PDL1結(jié)合。(3)收集轉(zhuǎn)染后各克隆株細(xì)胞上清與淋巴細(xì)胞混合共培養(yǎng),MTT法檢測(cè)融合蛋白對(duì)淋巴細(xì)胞增殖能力的影響;將CFSE染色后淋巴細(xì)胞與穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株共培養(yǎng),流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)淋巴細(xì)胞增殖情況及乳酸脫氫酶法檢測(cè)致后敏淋巴細(xì)胞

4、對(duì)B16-F1細(xì)胞株的殺傷作用。(4)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)；將轉(zhuǎn)染后各細(xì)胞株分別打入小鼠右背部皮下,觀察腫瘤的生長(zhǎng),腫瘤鼠的生存期及抑瘤率;并取各組小鼠的脾臟淋巴細(xì)胞與B16-F1細(xì)胞株共培養(yǎng),流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)淋巴細(xì)胞的增殖和特異性殺傷淋巴細(xì)胞數(shù)(CD8+和INF-γ雙陽(yáng)性),乳酸脫氫酶法檢測(cè)淋巴細(xì)胞殺傷作用及ELISA法檢測(cè)淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中分泌INF-γ量;由此判定融合蛋白的抗腫瘤作用的效果。
　　結(jié)果：(1)成功構(gòu)建pcDNA3.1(+)

5、/CRT、pcDNA3.1(+)/PD1、pcDNA3.1(+)/CRT-sPD1真核表達(dá)質(zhì)粒,經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定完全正確。(2)將構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染B16-F1細(xì)胞,通過(guò)G418篩選后,建立了穩(wěn)定穩(wěn)定表達(dá)CRT、PD1、CRT-sPD1蛋白的B16/3.1(+)/CRT、B16/3.1(+)/PD1、B16/3.1(+)/CRT-sPD1細(xì)胞株及對(duì)照細(xì)胞株B16/3.1(+)。(3)收集穩(wěn)定表達(dá)分泌性PD-1、CRT及CRT-sPD-1的

6、細(xì)胞培養(yǎng)上清,流式細(xì)胞儀檢測(cè)到PD1與CRT-sPD1能與EL4細(xì)胞表面的誘導(dǎo)表達(dá)的PDL1特異性結(jié)合。(4)收集上述的細(xì)胞上清刺激脾臟淋巴細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)融合蛋白CRT-sPD-1能夠顯著的促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖。(5)將上述穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株與混合淋巴細(xì)胞共培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)對(duì)照細(xì)胞株B16/3.1(+)明顯抑制淋巴細(xì)胞生長(zhǎng),但CRT-sPD-1克隆株能有效的促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖;將這些致敏后的淋巴細(xì)胞進(jìn)行CTL實(shí)驗(yàn),與對(duì)照組相比CRT-sPD-1克隆株致敏

7、的淋巴細(xì)胞對(duì)B16-F1細(xì)胞株的殺傷明顯增強(qiáng)。(6)腫瘤模型中,CRT-sPD1融合蛋白能夠有效的抑制腫瘤的生長(zhǎng),延長(zhǎng)腫瘤鼠的生存期。(7)制備各組腫瘤小鼠的脾臟淋巴細(xì)胞與B16-F1細(xì)胞共培養(yǎng),CRT-sPD1組小鼠淋巴細(xì)胞增殖能力增強(qiáng),特異性殺傷淋巴細(xì)胞數(shù)(CD8+和INF-γ雙陽(yáng)性)增多,分泌INF-γ增多,對(duì)B16-F1細(xì)胞的殺傷能力增強(qiáng)。
　　結(jié)論：(1)建立了穩(wěn)定表達(dá)mCRT-sPD1的細(xì)胞株；(2)分泌的mCRT-s