甲基牛扁亭對阿爾茨海默氏病細胞模型的作用及其相關(guān)分子機制的研究.pdf

1、目的：
　　本研究以MLA為工具，通過干預AD細胞模型，觀察其自噬改變并研究自噬在其中發(fā)揮的作用及參與調(diào)控的相關(guān)因子。這有助于明確AD的發(fā)病機制，進而為尋求新的治療方法提供可靠依據(jù)及方向。
　　1.研究外源性的Aβ25-35對SH-SY5Y細胞的毒性作用。
　　2.研究外源性的Aβ25-35是否能夠誘導SH-SY5Y細胞自噬及可能的作用機制。
　　3.研究外源性的A25-35誘導SH-SY5Y細胞的毒性及自噬的相

2、關(guān)性。
　　4.研究MLA是否可以保護SH-SY5Y細胞拮抗Aβ的毒性作用。
　　5.研究MLA是否可以拮抗Aβ誘導的SH-SY5Y細胞自噬及相關(guān)作用機制。
　　方法：
　　1.AD細胞模型的構(gòu)建、培養(yǎng):人神經(jīng)母細胞瘤細胞（SH-SY5Y細胞）正常培養(yǎng)，老化處理的Aβ25-35進行外源性干預，從而構(gòu)建AD細胞模型。
　　2.細胞存活率的檢測:MTT法檢測細胞存活率。
　　3.細胞凋亡的檢測:
　

3、　3.1 流式檢測，觀察細胞凋亡情況。
　　3.2 Hoechest33258染色結(jié)合熒光顯微鏡，觀察細胞核凝集。
　　4.細胞自噬的檢測:
　　4.1 電鏡觀察細胞內(nèi)自噬泡的數(shù)量及分布。
　　4.2 通過檢測LC3-Ⅱ蛋白水平明確自噬是否被誘導。
　　4.3 通MDC染色在熒光顯微鏡下觀察細胞中酸性膜泡的數(shù)量及分布。
　　5.siRNA干擾:通過beclin1 siRNA對細胞進行干擾，降低becl

4、in1在細胞中的表達水平。
　　6.細胞蛋白表達水平檢測:使用western blot法檢測LC3-Ⅱ，p70s6k，p-p70s6k、p62的蛋白水平。
　　結(jié)果：
　　1.Aβ誘導SH-SY5Y細胞毒性及其作用機制
　　1.1 Aβ25-35可引起SH-SY5Y細胞存活率下降，并且成一定的劑量和時間依賴性。
　　1.2 Aβ25-35可誘導SH-SY5Y細胞自噬增強。電鏡下觀察Aβ處理的SH-SY5Y細

5、胞，與對照組相比，細胞內(nèi)的自噬泡數(shù)量增加。5μ M、10μ M、20μ MAβ處理細胞4小時后可以引起細胞內(nèi)LC3-Ⅱ的表達水平增加。
　　1.3 Aβ25-35誘導SH-SY5Y細胞自噬形成增強，不影響自噬泡和溶酶體的結(jié)合。10μMAβ處理細胞4小時后，與對照組相比，可以引起細胞內(nèi)MDC標記的酸性膜泡數(shù)量增加，同時細胞內(nèi)p62降解明顯增加。氯喹可抑制自噬泡和溶酶體的結(jié)合過程，引起P62和LC3-Ⅱ表達增加，當Aβ25-35和氯喹

6、合用時，P62和LC3-Ⅱ表達增加進一步增加，說明Aβ25-35誘導自噬泡的形成增加，而不是阻斷自噬泡的降解。
　　1.4 Aβ25-35引起的SH-SY5Y細胞存活率下降與其誘導的自噬增強密切相關(guān)。Aβ處理24h后，經(jīng)流式法和Hoechst染色檢測，細胞凋亡沒有明顯增加。利用beclin1 siRNA降低細胞中自噬關(guān)鍵因子beclin1的表達發(fā)現(xiàn)，沉默beclin1的表達可以抑制Aβ誘導的細胞自噬;同時沉默beclin1的表達可

7、以明顯降低Aβ對SH-SY5Y的細胞毒性。
　　1.5 Aβ25-35誘導的自噬由mTOR信號通路介導。Aβ處理SH-SY5Y細胞4h后，與對照組相比，細胞內(nèi)mTOR的作用底物p70S6K的磷酸化水平降低，p-P70S6K/P70S6K比值降低。
　　2.甲基牛扁亭MLA保護SH-SY5Y細胞拮抗Aβ的細胞毒性及其作用機制
　　2.1 MLA預處理可改善Aβ25-35引起的SH-SY5Y細胞存活率的下降。與對照組相比，

8、5μ M、10μ M MLA預處理SH-SY5Y細胞可明顯抑制Aβ引起的細胞存活率的降低。同時，我們還觀察到，2.5μ M、5μ M、10μM、20μ M MLA處理細胞后，細胞存活率無明顯改變，說明其有良好的安全性。
　　2.2 MLA預處理可減弱Aβ25-35誘導的自噬。5μ MMLA預處理可減輕10μ MAβ外源性干預引起的SH-SY5Y細胞內(nèi)LC3-Ⅱ的增加;同時，還可以抑制Aβ引起的細胞內(nèi)MDC標記酸性膜泡數(shù)量的增加。<

9、br>　　2.3 MLA預處理通過增強mTOR信號通路，從而抑制Aβ25-35誘導的自噬。5μ MMLA預處理可拮抗Aβ引起的SH-SY5Y細胞內(nèi)mTOR的底物p70S6K的磷酸化水平降低，p-P70S6K/P70S6K比值降低。
　　結(jié)論：
　　1.Aβ可以引起SH-SY5Y細胞毒性作用，減少細胞存活率，呈一定劑量和時間依賴性。
　　2.Aβ可以誘導SH-SY5Y細胞自噬增強，主要是通過增強自噬的形成，對自噬成熟過程