MYC調(diào)節(jié)CHK1和CHK2引起鼻咽癌干細(xì)胞放射抵抗的機(jī)制.pdf

1、背景和目的：
　　 鼻咽癌(NPC)是一種發(fā)生于鼻咽粘膜的惡性腫瘤。占頭頸部惡性腫瘤的78.08％，占上呼吸道癌腫的92.99％。我國(guó)是鼻咽癌發(fā)病率最高的國(guó)家，而廣東、廣西、海南等地都是高發(fā)區(qū)，其發(fā)病率大約是25-50例每100，000人，高于西方國(guó)家25倍。由于其特殊的解剖位置，所以手術(shù)的方法受到局限，因此治療主要依賴于放射治療。然而，即使給予根治劑量，5年內(nèi)仍有約30％的患者出現(xiàn)局部腫瘤復(fù)發(fā)，30％至60％的患者發(fā)生轉(zhuǎn)移。<

2、br>　　 腫瘤干細(xì)胞(CSC/TSC)的概念于2001年被正式提出。腫瘤干細(xì)胞具有四個(gè)重要特征:1、自我更新的能力。自我更新能力是腫瘤干細(xì)胞保持分化為前體細(xì)胞的能力。2、多分化潛能。多分化潛能使腫瘤干細(xì)胞能夠產(chǎn)生不同分化程度的子代腫瘤細(xì)胞，在體內(nèi)形成新的腫瘤。同一腫瘤組織中,分化成熟的腫瘤細(xì)胞惡性程度較低，而分化差的腫瘤細(xì)胞惡性程度高。3、高增值能力。大量實(shí)驗(yàn)表明，CSC/TSC比普通腫瘤細(xì)胞具有更高的增值能力。4、耐藥性。多藥耐藥

3、是導(dǎo)致腫瘤治療失敗的主要原因之一。腫瘤干細(xì)胞細(xì)胞膜上多數(shù)表達(dá)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體家族膜蛋白，能夠運(yùn)輸并排出代謝產(chǎn)物，藥物等物質(zhì)，使得許多對(duì)腫瘤非干細(xì)胞具有抑制或殺傷作用的化療藥物在腫瘤干細(xì)胞上發(fā)揮不了殺傷作用，或作用明顯減弱。目前，使用干細(xì)胞表面標(biāo)記ALDH1+、CD44、CD133等，可以識(shí)別乳腺、腦、肺、肝癌的干細(xì)胞。最近的一項(xiàng)研究表明，干細(xì)胞可以通過優(yōu)先激活CHK1和CHK2的細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn),增加DNA修復(fù)能力從而引起輻射耐受。
　

4、　 c-MYC基因是MYC基因家族的重要成員之一，是一種可使細(xì)胞無限增殖，獲永生化功能，促進(jìn)細(xì)胞分裂的基因，因與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)。c-MYC基因的表達(dá)一般與細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)有關(guān)，然而在細(xì)胞分化時(shí)c-MYC表達(dá)則降低，發(fā)現(xiàn)c-MYC在細(xì)胞G0期到S期的過程中也起作用。表明c-MYC表達(dá)的變化與細(xì)胞的增殖及分化狀態(tài)有關(guān)，其表達(dá)產(chǎn)物在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化或惡性轉(zhuǎn)化中發(fā)揮作用。MYC可以通過抑制p27激活cyclin E/Cdk2使成纖維細(xì)胞

5、靜止。以往的研究還表明， MYC可以同時(shí)激活p53和pten引起正常的和惡性干/祖細(xì)胞的分化，自我更新，及致瘤性。
　　 本研究的目的是，根據(jù)PKH26熒光染料的特性，識(shí)別具有慢周期特性的PKH26+細(xì)胞，通過明確c-MYC對(duì)CHK1/2.的直接調(diào)節(jié)作用，闡述PKH26+細(xì)胞具有輻射抗性的機(jī)制，旨在揭示c-MYC介導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)在鼻咽癌放療抵抗中的作用。
　　 方法：
　　 1.細(xì)胞和培養(yǎng)條件本實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞均

6、由本實(shí)驗(yàn)室保存。人鼻咽癌細(xì)胞株培養(yǎng)于含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，青霉素100U/ml，鏈霉素100μg/ml，于37℃、5％ CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。分選后的PKH26+以及PKH26-細(xì)胞使用的是無血清的未分化培養(yǎng)基(MEBM; Clonetics division ofCambrex BioScience)進(jìn)行維持培養(yǎng)。
　　 2.腫瘤球培養(yǎng):
　　 將分選鼻咽癌細(xì)胞及經(jīng)過不同方式處理后的細(xì)胞，置于低粘附

7、培養(yǎng)板中，用含DMEM-F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，含2％ N2，2％ B27，20 ng/mL HGF，100ng/mLEGF，and1％真菌抗生素，懸浮于培養(yǎng)，觀察細(xì)胞形成腫瘤干細(xì)胞球的過程。
　　 3.免疫熒光
　　 將待檢測(cè)樣品放入放有蓋玻片的6孔板中，4％多聚甲醛固定，PBS清洗，0.5％Triton X-100破膜，PBS清洗，加入一抗37℃孵育45min，PBS清洗，洗滌后加入熒光二抗，37℃孵育45min，PBS清

8、洗，DAPI染細(xì)胞核，在共聚焦顯微鏡下觀察。
　　 4.細(xì)胞周期分析用胰蛋白酶消化細(xì)胞，用PBS洗滌，在懸浮在70％乙醇中，-20℃并儲(chǔ)存過夜。隨后離心，在PBS中洗滌，再懸浮在450ml的PBS和10ml，10mg/ml無DNase的RNase中，在37℃孵育45分鐘。RNase處理后，溶液中加入50μl的PI，細(xì)胞在室溫下孵育10分鐘，避光。分析之前，通過過濾除去細(xì)胞團(tuán)塊，使用BDFACSDiva，對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行了分析。

9、r>　　 5.側(cè)群細(xì)胞檢測(cè)將貼壁細(xì)胞或處理后的腫瘤細(xì)胞分離成單個(gè)細(xì)胞，離心后用PBS清洗，含2％胎牛血清的1640培基重懸，用Hoechst33342標(biāo)記，標(biāo)記的細(xì)胞在37℃孵育90min, PBS洗滌，重懸，檢測(cè)前加入Propidium Iodide標(biāo)記死細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)側(cè)群比例。
　　 6.免疫印跡檢測(cè)蛋白質(zhì)在SDS-PAGE凝膠上進(jìn)行分析，將分離的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，PVDF膜浸泡在封閉液中25℃2h，一抗4℃

10、孵育過夜，PVDF膜與二抗在室溫下孵育1h，采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)。
　　 使用以下抗體:鼠抗人cyclin D1，cyclin A, and cyclin B(1∶300)，鼠抗人ABCG2, CD-44, CHK1,CHK2,pCHK1, pCHK2 GAPDH(1∶1,000),和γ-H2AX(1∶1，000)。
　　 7.克隆形成生存分析將剛分選的PKH26+和PKH26細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，并接種于6孔培養(yǎng)板。在室溫下，使

11、用直線加速器（2100EX，瓦里安）進(jìn)行照射，劑量率300cGy的/分鐘，并培養(yǎng)14天。接著，將存活的克隆數(shù)目（定義為具有≥50個(gè)細(xì)胞的菌落）進(jìn)行計(jì)數(shù)。
　　 8.免疫組織化學(xué)石蠟切片經(jīng)脫蠟，乙醇梯度水化，抗原修復(fù)，滅活內(nèi)源性過氧化物酶，一抗4℃孵育過夜，二抗25℃孵育10min，DAB顯色，顯微鏡觀察顯色，蘇木素復(fù)染核，鹽酸乙醇分化，脫水，透明。
　　 9.實(shí)時(shí)定量(定量RT-PCR)表達(dá)CHK1，CHK2，c-MYC

12、使用的Taq-Man(@) MicroRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，TaqMan通用PCR擴(kuò)增預(yù)混試劑，根據(jù)由制造商提供的說明，使用二步法進(jìn)行實(shí)時(shí)定量RT-PCR測(cè)定，GAPDH作為內(nèi)參歸一化。
　　 10.熒光素酶檢測(cè)pGL4-hRluc/TK載體購(gòu)自Promega公司。選定CHK1和CHK2的啟動(dòng)子基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并克隆到pGL4載體中。根據(jù)制造商提供的說明書，使用雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒(Promega)，檢測(cè)熒光素和Renilla

13、熒光素酶的活性。在CHK1和CHK2啟動(dòng)子區(qū)域，突變c-MYC基因與其結(jié)合位點(diǎn)，使用QuikChange多定點(diǎn)突變?cè)噭┖校⊿tratagene公司）根據(jù)制造商提供的使用說明書對(duì)相應(yīng)位點(diǎn)進(jìn)行突變。
　　 11.c-MYC綁定位點(diǎn)預(yù)測(cè)和ChIP實(shí)驗(yàn)c-MYC在CHK1，CHK2啟動(dòng)子區(qū)域的綁定位點(diǎn)的預(yù)測(cè)使用的是Patch軟件(http://www.biobase-international.com/gene-regulation)。

14、來自CNE2細(xì)胞的DNA的準(zhǔn)備和細(xì)胞的裂解使用的是EZ-Zyme Chromatin Prep試劑盒(Millipore)。裂解后的樣品是用EZ-Magna ChIP試劑盒(Millipore)。所有的步驟均按照說明書進(jìn)行操作。用來做CHIP的抗c-MYC抗體來自Santa Cruz Biotechnology，Inc。在CHIP分析準(zhǔn)備完成以后，DNA樣品的擴(kuò)增使用的引物見正文。
　　 12.體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)接種時(shí)細(xì)胞用100μl

15、按1∶1 RPMI-1640和Matrigel懸浮，觀察其成瘤情況如下，記錄小鼠腫瘤發(fā)生的時(shí)間;根據(jù)公式V=1/ab2（a為長(zhǎng)徑，b為短徑）計(jì)算腫瘤體積，繪制腫瘤成長(zhǎng)曲線，腫瘤生長(zhǎng)數(shù)周后處死動(dòng)物取出腫瘤組織。
　　 13.統(tǒng)計(jì)方法采用統(tǒng)計(jì)軟件Graphpad5.0對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理和分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。兩組腫瘤體積比較采用兩獨(dú)立樣本T檢驗(yàn);腫瘤球形成，PKH26陽性細(xì)胞和側(cè)群比例，細(xì)胞周期，動(dòng)物成瘤

16、時(shí)間數(shù)據(jù)均采用單因素方差分析(One-way ANOVA)比較各組差異，如方差齊性，多重比較采用LSD法;如方差不齊，采用Welch值，多重比較采用Dunnett T3法;在體腫瘤生長(zhǎng)曲線的比較采用兩因素方差分析（two-way ANOVA）比較各組間差異。P＜0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 結(jié)果：
　　 1.鼻咽癌中PKH26+細(xì)胞的生物學(xué)特性在不同時(shí)間段用流式細(xì)胞儀檢測(cè)PKH26+細(xì)胞的比例，在第四周CNE1為2

17、.2％，CNE2為2.8％，分選這個(gè)比例的PKH26+的細(xì)胞進(jìn)行下面的實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)PKH26+細(xì)胞的細(xì)胞周期，發(fā)現(xiàn)主要處于G1期(DNA合成前期)，細(xì)胞周期蛋白cyclinD1，A在PKH26+的細(xì)胞中也高表達(dá)。分別檢測(cè)CNE1和CNE2細(xì)胞中的側(cè)群比例，可以看到PKH26+的細(xì)胞中比例明顯高于PKH26-的細(xì)胞。WeaernBlot檢測(cè)干細(xì)胞表面標(biāo)記ABCG2和CD44也證實(shí)了這一點(diǎn)。經(jīng)過照射后PKH26+的細(xì)胞腫瘤球數(shù)目明顯多于PHK

18、26-的細(xì)胞;克隆形成實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)照射后PKH26+和PKH26-細(xì)胞的存活率，經(jīng)過8Gy的照射PKH26+的細(xì)胞克隆和照射前無明顯差別，而PKH26-的細(xì)胞8Gy基本上都?xì)⑺懒恕?br>　　 2.PKH26+細(xì)胞引起的輻射抗性主要是通過c-MYC過表達(dá)。
　　 給予PKH26+和PKH26-細(xì)胞8Gy的劑量，Western Blot檢測(cè)pCHK1、pCHK2、CHK1、CHK2個(gè)基因，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過照射PKH26+和PKH26-細(xì)胞中

19、CHK1和CHK2磷酸化水平均提高，但是，PKH26+細(xì)胞的磷酸化活化水平明顯高于PKH26-的細(xì)胞，表明PKH26+細(xì)胞表現(xiàn)出更大DNA損傷激活反應(yīng)。免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞照射后PKH26+細(xì)胞c-MYC，pChk1，pChk2表達(dá)的增加，而且這三個(gè)基因均定位于細(xì)胞核中PKH26+細(xì)胞。為了闡明c-MYC和DNA損傷反應(yīng)之間的關(guān)系，我們?cè)诒茄拾┘?xì)胞株CNE1和CNE2中構(gòu)建了c-MYC的過表達(dá)載體。我們發(fā)現(xiàn)，DNA損傷相關(guān)蛋白γ-H2

20、AX的水平大大降低。在彗星實(shí)驗(yàn)，顯示CNE1和CNE2細(xì)胞中過度表達(dá)c-My基因，DNA損傷細(xì)胞的比例明顯下降了。生物信息學(xué)的方法檢測(cè)了CHK1和CHK2基因上游約2000bp,分別發(fā)現(xiàn)了三個(gè)潛在的c-MYC基因的結(jié)合位點(diǎn)。在CNE2中進(jìn)行(CHIP)分析c-MYC的所有假定位點(diǎn)。研究結(jié)果表明，c-MYC是最顯著綁定的位點(diǎn)是CHK1和CHK2的C和E位點(diǎn)。敲除c-MYC的可以減弱c-MYC與CHK1和CHK2的C和E位點(diǎn)的結(jié)合。熒光素酶

21、報(bào)告基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)c-MYC基因過表達(dá)，也可以使CHK1和CHK2的熒光素酶表達(dá)增加，突變C和E位點(diǎn)結(jié)果表明，突變后c-MYC基因的過度表達(dá)沒有使CE位點(diǎn)熒光素酶的活性增加。
　　 3.c-MYC過表達(dá)增強(qiáng)PHK26+細(xì)胞的DNA修復(fù)能力和干性先在鼻咽癌細(xì)胞中沉默c-MYC基因，檢測(cè)照射后c-MYC表達(dá)和DNA損傷反應(yīng)，緊接著，在PKH26+細(xì)胞中抑制c-MYC側(cè)群細(xì)胞比例減少，CNE1的PKH26+細(xì)胞側(cè)群比例從32.8％降至2

22、.4％，CNE2的PKH26+細(xì)胞側(cè)群比例從35.67％降至2.0％。為了進(jìn)一步證實(shí)我們的假設(shè)，我們收集CNE1和CNE2細(xì)胞株的PKH26+細(xì)胞進(jìn)行腫瘤球形成實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)抑制c-MYC可以減少的腫瘤球數(shù)目。堿性彗星試驗(yàn)中，我們用shc-MYC處理PKH26+細(xì)胞與對(duì)照組相比，損傷明顯增加。
　　 4.c-MYC基因通過調(diào)節(jié)Chk1/2介導(dǎo)PK-H26+細(xì)胞的DNA損傷反應(yīng)和抗輻射在CNE1和CNE2中抑制CHK1/2，用WB檢測(cè)

23、抑制效率。然后用彗星實(shí)驗(yàn)證實(shí)慢病毒載體sh-Chk1/2干擾Chk1/Chk2的表達(dá)能使PKH2+細(xì)胞DNA損傷修復(fù)能力減弱。緊接著，對(duì)PKH26+細(xì)胞進(jìn)行了為了c-MYC和CHK1/2的共感染，通過克隆形成實(shí)驗(yàn)、Western Blot檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)PKH26+細(xì)胞耐放療。此外，c-MYC基因的抑制可以引起PKH26+細(xì)胞對(duì)放射敏感，c-MYC基因介導(dǎo)的DNA修復(fù)取決于CHK1/2的活化。把分選的PKH26+細(xì)胞對(duì)裸鼠進(jìn)行皮下注射。結(jié)合腫

24、瘤的體積和重量，我們發(fā)現(xiàn)給予不同的射線治療方式或Si-C-MYC并被沒有顯著的抑制腫瘤生長(zhǎng)，si-c-MYC與放療進(jìn)行聯(lián)合則可以明顯抑制腫瘤生長(zhǎng)。WesternBlot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)與未處理的腫瘤相比，用IR和si-c-MYC處理的腫瘤c-MYC，CHK1/2，和pCHK1/2表達(dá)水平降低。我們用免疫組織化法在62例原發(fā)的鼻咽癌標(biāo)本檢測(cè)這些基因的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)c-MYC基因的高表達(dá)與CHK1/2和CD44的表達(dá)水平呈正相關(guān)。
　　 結(jié)