轉(zhuǎn)染Chk1、Chk2基因人臍帶間充質(zhì)干細胞對腦腫瘤放療抵抗機制信號通路途徑的研究.pdf

1、第一部分人臍帶間充質(zhì)干細胞治療腦腫瘤的探討性
　　 研究目的：探討人臍帶間充質(zhì)干細胞（Human umbilical cord mesenchymal stemcells，HUCMSCs）有對腫瘤定向遷移作用可以作為理想的基因治療載體以及間充質(zhì)干細胞本身分泌一些細胞因子可以抑制腫瘤生長的雙向治療途徑的優(yōu)勢，進行在細胞生物學上和分子生物學上對腫瘤細胞促使腫瘤細胞凋亡的影響和作用機制研究。
　　 方法：利用人臍帶組織經(jīng)膠原酶

2、消化后提取間充質(zhì)干細胞，經(jīng)流式細胞技術鑒定表面標志物，傳代培養(yǎng)，利用Transwell 小室試驗，以BV2 小膠質(zhì)細胞為正常對照，觀察間充質(zhì)干細胞對腫瘤細胞的遷移作用，間充質(zhì)干細胞和腫瘤細胞共培養(yǎng)、明膠酶譜和反向明膠酶譜來觀察間充質(zhì)干細胞對腫瘤細胞的抑制作用的細胞生物學效應，
　　 結果：Transwell 小室可見間充質(zhì)干細胞對腫瘤遷移顯著，間充質(zhì)干細胞和U251 腫瘤細胞共培養(yǎng)可觀察到U251 腫瘤細胞的細胞間質(zhì)呈現(xiàn)空泡樣變

3、化，一個星期左右腫瘤細胞破碎、凋亡，而間充質(zhì)干細胞和腫瘤干細胞分別用不同的熒光染料共培養(yǎng)后，亦可見間充質(zhì)干細胞和腫瘤干細胞相互遷移整合在細胞間質(zhì)，明膠酶譜和反向明膠酶譜可見間充質(zhì)干細胞可分泌類組織金屬蛋白酶抑制劑（TIMP）抑制腫瘤細胞分泌的基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）。
　　 結論：間充質(zhì)干細胞有向腫瘤定向遷移的作用，并且其可以分泌細胞因子作用于腫瘤細胞，促使腫瘤細胞生長的抑制和促進腫瘤細胞的凋亡；在作為基因治療來說，是一個很理

4、想的基因載體，另一方面可以抑制腫瘤細胞的生長，對于使用間充質(zhì)干細胞可以治療腫瘤的特性，結合基因治療腫瘤的治療途徑是一個很理想且一舉兩得的治療方式。
　　 第二部分構建慢病毒載體轉(zhuǎn)染干擾CHK1/2基因?qū)δX膠質(zhì)瘤放療抑制抵抗性的研究目的：構建慢病毒載體轉(zhuǎn)染干擾CHK1/2（checkpoint kinase 1/2）基因。為研究干擾CHK1/2基因的表達對腦膠質(zhì)瘤細胞放療抵抗性的抑制進而增加放療的敏感性，促進腫瘤細胞的凋亡。

5、>　　 方法：根據(jù)GenBank 數(shù)據(jù)提供的Chk1 及Chk2基因核苷酸序列，各選擇設計一條適合轉(zhuǎn)錄短發(fā)夾RNA（Small hairpin RNA，shRNA）的DNA序列，與pLK0.1 質(zhì)粒載體鏈接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，選擇單克隆，提取質(zhì)粒，使用限制性內(nèi)切酶EcoRI 及NcoI 酶切，瓊脂糖凝膠電泳，DNA序列鑒定。通過慢病毒轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細胞系U251 進行傳代擴增。將轉(zhuǎn)染的U251 膠質(zhì)瘤細胞系經(jīng)紫外線照射后，用RT-PCR

6、和Western blot 方法分別在mRNA和蛋白水平上測定CHK1及CHK2的表達。
　　 結果：重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，經(jīng)EcoRI 及NcoI 酶切后瓊脂糖凝膠電泳結果，表明寡核苷酸成功插入到所計劃的位點，測序鑒定正確，轉(zhuǎn)染MSC組（對照）和U251組mRNA和蛋白水平表達幾乎一致，經(jīng)紫外線照射后Chk1、Chk2基因表達明顯減弱。
　　 結論：成功構建干擾Chk1、Chk2的shRNA表達，轉(zhuǎn)染后的細胞

7、可抑制Chk1、Chk2基因的表達，進而為增加腫瘤放療敏感性的研究和臨床治療奠定了很好的理論基礎。
　　 第三部分干擾下調(diào)Chk1/Chk2基因的表達對慢病毒轉(zhuǎn)染后膠質(zhì)瘤細胞信號通路增加放療敏感效應
　　 研究目的：研究通過慢病毒轉(zhuǎn)染干擾CHK1/2（Checkpoint kinase 1/2）基因后使得無法傳達下調(diào)信號cdc25家族成員和其他底物無法磷酸化，損傷信號無法傳遞到下游，而使得細胞周期無法阻止，損傷修復等生物

8、學任務傳遞失效，損傷的DNA錯配或者復制壓力增加而造成復制失敗或錯配后導致蛋白質(zhì)無法發(fā)揮正常的生物學校應導致細胞凋亡。
　　 方法：將U251腫瘤細胞系通過慢病毒轉(zhuǎn)染干擾CHK1/2基因的表達，使用紫外線和X-ray照射細胞，比較沒有經(jīng)過干擾的腫瘤細胞和干擾后的腫瘤細胞的生物學變化和生存時間，通過RT-PCR、Real-time PCR和Westrn blot檢驗RNA和蛋白質(zhì)水平。
　　 結果：經(jīng)過轉(zhuǎn)染干擾基因的腫瘤細

9、胞受到離子和非離子射線照射后相較于沒有經(jīng)過干擾基因轉(zhuǎn)染的腫瘤細胞生存時間短，在RNA和蛋白質(zhì)水平可見所表達的差異。
　　 結論：CHK1/2是磷脂酰肌醇-3-激酶樣激酶家族(PIKKs,phosphatedyl-inositol-3-kinase-like protein kinases)成員，ATM、ATR的下游底物，在經(jīng)過離子輻射、紫外線輻射等引起DNA損傷時被激活，但慢病毒轉(zhuǎn)染U251膠質(zhì)瘤細胞系干擾CHK1、CHK2基因