豆類絲核菌及其次級(jí)代謝產(chǎn)物有效成分的分離研究.pdf

1、目的：旨在探索豆類絲核菌菌絲體及其次級(jí)代謝產(chǎn)物的成分，分析其各成分的用途，為開拓豆類絲核菌的新用途奠定理論基礎(chǔ)。 方法：1.定期用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)移接豆類絲核菌，使之保持旺盛的生長力。2.將特定的豆類絲核菌菌株用改良的Czapek's培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，獲得豆類絲核菌培養(yǎng)液和豆類絲核菌菌絲體。3.用不同的方法對(duì)菌絲體和次級(jí)代謝產(chǎn)物分別進(jìn)行處理。①對(duì)豆類絲核菌菌絲體的處理：將自然干燥的豆類絲核菌菌絲體用0.5％的鹽酸進(jìn)

2、行浸泡24h后應(yīng)用40KHz超聲波清洗器在70℃處理30min，收集提取液，如此重復(fù)三次，合并提取液。將提取液在60℃條件下減壓濃縮，備用。用2mol/L鹽酸調(diào)提取液為pH2，加入新鮮配制的雷氏鹽飽和水溶液，有沉淀生成，濾集生成的沉淀，并將沉淀溶于丙酮，濾除不溶物，向丙酮溶液中加入硫酸銀飽和水溶液，使沉淀分解。過濾后向?yàn)V液中加入一定量氯化鋇溶液，過濾，濾液用2mol/L氨水將之調(diào)pH10，揮干得到褐色粘稠狀帶有特異性香味的物質(zhì)。將其在9

3、0℃下減壓升華得到白色晶體。②對(duì)豆類絲核菌培養(yǎng)液的處理：方法一，取1000ml預(yù)處理完備的豆類絲核菌培養(yǎng)液，在60℃減壓濃縮，濃縮液調(diào)pH2，用正丁醇萃取10次，得到有機(jī)相和酸水液。將酸水液調(diào)至pH10，再用正丁醇萃取10次得到水相和有機(jī)相。有機(jī)相用0.2mol/L的稀硫酸萃取，得到水相和有機(jī)相。將水相用濃氨水堿化后濃縮至干，所得浸膏減壓升華得到白色粉末狀物質(zhì)。方法二，取1000ml預(yù)處理完備的豆類絲核菌培養(yǎng)液，調(diào)pH10，用H2O∶C

4、H2Cl2(3∶1，v/v)萃取，棄去CH2Cl2層，將水層調(diào)pH10后，再用H2O∶CH2Cl2(3∶1，v/v)萃取，棄去CH2Cl2層，將水層調(diào)pH7，濃縮后上732型強(qiáng)酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂，先用去離子水沖洗，后用1mol/LNH4OH洗脫，收集氨洗液，調(diào)pH7，濃縮后凍干，得到淺黃色粉末，將之減壓升華得到白色粉末狀物質(zhì)。方法三，取1000ml預(yù)處理完備的豆類絲核菌培養(yǎng)液，調(diào)pH7，上大孔吸附樹脂，反復(fù)富集5次，靜置12h，

5、用滴水沖洗，洗2個(gè)柱體積，收集水洗脫液，再用乙醇洗脫，收集約2個(gè)柱體積的醇水混合洗脫液，最后收集2個(gè)柱體積的醇洗脫液，分別減壓濃縮各洗脫段的液體，經(jīng)TLC檢測(cè)，合并醇洗液，減壓回收乙醇，余液凍干，得到褐色粉末。TLC則可檢出，與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，均呈現(xiàn)淡紫色，但由于純度較差難以升華。 結(jié)果：經(jīng)過熔點(diǎn)測(cè)定儀和GC-MS檢測(cè)，初步鑒定豆類絲核菌菌絲體中可能含有蒲公英甾醇、α-香樹脂醇、大狼毒素以及兩種未知的化合物。這幾種物質(zhì)均是首次從豆類