雄海馬孵化袋c(diǎn)DNA文庫的EST分析以及海馬假定蛋白酶抑制劑基因的表達(dá)與性質(zhì)鑒定.pdf

1、對文庫中發(fā)現(xiàn)一個(gè)WAP結(jié)構(gòu)域蛋白基因進(jìn)行結(jié)構(gòu)與功能的分析和研究,并用原核表達(dá)的方法獲得重組蛋白,以期對孵化袋內(nèi)的功能蛋白獲得更多的了解,并試圖開發(fā)該蛋白潛在功能使其獲得更大的利用.應(yīng)用SMART<'TM> cDNA Library Construction技術(shù).以雄性大海馬孵化袋為原始材料,構(gòu)建以真核表達(dá)載體pcDNA3為基礎(chǔ)的孵化袋c(diǎn)DNA文庫.通過對1975個(gè)隨機(jī)克隆的序列測定和生物信息學(xué)分析,獲得了951個(gè)新的基因序列,包括156

2、個(gè)cluster和795個(gè)singleton.其中有大量的小分子結(jié)合與運(yùn)輸?shù)鞍谆?、先天免疫相關(guān)蛋白基因以及孵化相關(guān)酶類、胚胎發(fā)生相關(guān)蛋白轉(zhuǎn)錄子,這些EST的分布從一個(gè)側(cè)面反應(yīng)了孵化袋的生物功能,為孵化袋是一個(gè)雄性親體上的類子宮器官提供了分子生物學(xué)上的佐證.孵化袋c(diǎn)DNA文庫的成功構(gòu)建以及對其中所得基因的進(jìn)一步功能研究,將為海馬雄性孵化行為提供更多的信息,為從分子水平找到海馬雄性孵化的進(jìn)化理由與選擇壓力提供新的思路和線索.通過對海馬cD

3、NA文庫的隨機(jī)測序和分析,得到一個(gè)501bp的編碼一個(gè)全新的WAP結(jié)構(gòu)域蛋白的全長cDNA序列.它的讀碼框編碼167個(gè)氨基酸殘基的前體蛋白,編碼24個(gè)氨基酸殘基的信號肽和143個(gè)氨基酸殘基的成熟蛋白.BLAST結(jié)果表明,該cDNA與溪紅點(diǎn)鮭魚(Salvelinus fontinalis)的排卵蛋白前體具有明顯的同源性,蛋白質(zhì)序列同源性有57％左右.序列分析表明,該蛋白由于具有明顯的WAP結(jié)構(gòu)域而應(yīng)該屬于WAP結(jié)構(gòu)域家族蛋白.WAP結(jié)構(gòu)域

4、家族蛋白是一類組織來源廣泛,功能多樣的大家族,在已經(jīng)鑒定功能的該家族蛋白中,大多數(shù)具有絲氨酸蛋白酶抑制劑活性和細(xì)胞增值的調(diào)節(jié)作用,故將該蛋白命名為假定蛋白酶抑制劑(hkHPI).由Blast結(jié)果還可以看出,從海馬文庫中找到的WAP結(jié)構(gòu)域家族蛋白新成員hkHPI除了結(jié)構(gòu)域骨架氨基酸與WAP家族成員具有較高的相似性以外,其余氨基酸缺乏同源性,這一點(diǎn)上與該家族其他成員之間的特征相吻合,暗示hkHPI除了可能具有潛在的蛋白酶抑制劑功能外還有其他