沉默Orai1對小鼠睪丸支持細胞影響的研究.pdf

1、睪丸對于男性的生殖與發(fā)育有著重要的影響，它能夠形成精子，使人類得以繁衍后代；能夠維持男性第二性征，并促進男性生殖器官的發(fā)育。睪丸中存在三種主要細胞：生殖細胞、間質(zhì)細胞、支持細胞。其中睪丸中支持細胞有很重要的作用，它能夠分泌雄激素結(jié)合蛋白和抑制素，對于雄激素的分泌、運輸起著重要的作用。
　　1986年James Putney就提出了鈣觸發(fā)鈣釋放的觀點—即SOCE。SOCE主要由位于質(zhì)膜上的Orai蛋白和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的STIM蛋白構(gòu)成。

2、STIM蛋白的N端有EF-Hand，位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)，正常情況下與鈣離子結(jié)合。當胞漿中的鈣離子濃度降低時，EF-Hand就會釋放鈣離子，并同時作出反應(yīng)，使STIM蛋白向Orai蛋白靠近，打開Orai通道，使細胞外的鈣離子進入細胞內(nèi)。
　　近年來，SOCE及TRP通道在非興奮細胞中的研究越來越得到重視。對于睪丸中存在的鈣通道，大多數(shù)研究都集中在生殖細胞，其中生殖細胞的SOCE及TRP通道已有部分相關(guān)研究。在小鼠生殖細胞中，TRPC普遍存

3、在于頂體反應(yīng)區(qū)域，而小窩蛋白是構(gòu)成生殖細胞SOCE重要的蛋白。但是，支持細胞中存在的鈣通道多數(shù)集中在電壓門控鈣通道，有關(guān)支持細胞SOCE的研究較少。支持細胞是否存在SOCE并不清楚。
　　在預實驗中，小鼠睪丸支持細胞通過Western Blot研究，發(fā)現(xiàn)有Orai1蛋白和STIM1蛋白，即存在SOCE通道。為了進一步證明Orai1蛋白和STIM1蛋白，采用共聚焦技術(shù)也發(fā)現(xiàn)存在這兩種蛋白的存在。通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的方法，轉(zhuǎn)染 luc、Yf

4、p-EV作為對照，轉(zhuǎn)染sho沉默小鼠支持細胞系中的Orai1，觀察鈣影像發(fā)現(xiàn)實驗組的第二個峰要比對照組低，證明有較少鈣離子進入細胞內(nèi)。用低濃度的Gd3+抑制Orai1通道，發(fā)現(xiàn)支持細胞實驗組比對照組的第二個峰值明顯要低，也說明實驗組有較少的鈣離子進入。
　　為了得到穩(wěn)定的細胞系，通過luc、sho慢病毒感染支持細胞，用Puro篩選，最后得到luc和sho的單克隆細胞系。實驗中分別用鈣影像和Western Blot兩種方法鑒定所挑選