茶多酚對(duì)草甘膦致小鼠睪丸支持細(xì)胞損傷的保護(hù)作用.pdf

1、目的：研究茶多酚（tea polyphenols，TP）對(duì)草甘膦（glyphosate）誘導(dǎo)小鼠睪丸支持細(xì)胞（sertoli cell，SC）氧化損傷的保護(hù)作用，并初步探討其可能的作用機(jī)制。
　　方法：分離、純化、體外培養(yǎng)18~20日齡小鼠睪丸支持細(xì)胞，采用FasL免疫細(xì)胞化學(xué)方法鑒定支持細(xì)胞純度，將培養(yǎng)5~7d的支持細(xì)胞隨機(jī)分組：以草甘膦60μg/ml、90μg/ml、120μg/ml、150μg/ml、180μg/ml五個(gè)濃度

2、對(duì)支持細(xì)胞損傷24h，根據(jù)不同劑量對(duì)支持細(xì)胞的抑制率，計(jì)算出草甘膦的半數(shù)抑制濃度（IC50），以草甘膦IC50染毒24h建立支持細(xì)胞損傷模型；茶多酚保護(hù)組：以茶多酚5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml、160μg/ml六個(gè)濃度分別預(yù)處理細(xì)胞12h后再給予草甘膦半數(shù)抑制濃度損傷24h，觀察不同濃度茶多酚對(duì)草甘膦誘導(dǎo)支持細(xì)胞損傷的影響。噻唑藍(lán)（MTT）法檢測支持細(xì)胞存活率，觀察茶多酚對(duì)草甘膦損傷支持細(xì)

3、胞存活率的影響；用倒置顯微鏡觀察支持細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變；比色法檢測乳酸脫氫酶(LDH)釋放量；測定細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）的活力及丙二醛(MDA)的含量；采用Hoechst33342熒光染色法觀察不同處理因素對(duì)細(xì)胞核形態(tài)的改變；TUNEL法原位檢測細(xì)胞凋亡情況；采用半定量RT-PCR觀察支持細(xì)胞ABP mRNA、Vimentin mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)果：⑴經(jīng)Fas-L免疫細(xì)胞化學(xué)染色法鑒定

4、，分離純化后所得到的小鼠睪丸支持細(xì)胞純度達(dá)到90％以上。⑵加入不同濃度的草甘膦(60μg/ml、90μg/ml、120μg/ml、150μg/ml、180μg/ml)，損傷支持細(xì)胞24h后，草甘膦對(duì)支持細(xì)胞活性的損傷呈劑量依賴性。根據(jù)不同劑量抑制率計(jì)算出草甘膦的半數(shù)抑制濃度為90μg/ml。⑶不同的茶多酚預(yù)處理時(shí)間和預(yù)處理濃度對(duì)支持細(xì)胞產(chǎn)生不同的影響，可明顯拮抗草甘膦90μg/ml對(duì)支持細(xì)胞存活率的抑制作用，茶多酚40μg/ml、80μ

5、g/ml預(yù)處理12h，細(xì)胞存活率提高至78.6%和86.2%；茶多酚20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml預(yù)處理24h與茶多酚10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml預(yù)處理48h，能夠修復(fù)草甘膦所誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性損傷。⑷Hoechst33342熒光染色觀察核形態(tài)，正常對(duì)照組細(xì)胞呈均勻熒光淡染，胞核呈圓形，草甘膦90μg/ml損傷細(xì)胞24h后，可見部分細(xì)胞出現(xiàn)致密結(jié)構(gòu)、核固縮裂解，進(jìn)行 TUNEL細(xì)胞凋亡檢測，經(jīng)過茶多酚10μ

6、g/ml、20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml預(yù)處理24h，凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變有所改善，細(xì)胞凋亡率明顯降低，與草甘膦組比較差異顯著(P<0.05, P<0.01)。⑸檢測細(xì)胞損傷指標(biāo)，與正常對(duì)照組比較，草甘膦損傷組細(xì)胞內(nèi) LDH釋放量增高、SOD、GSH-Px活性降低、MDA含量增高。經(jīng)過茶多酚預(yù)處理后LDH釋放明顯減少、SOD、GSH-Px活性明顯提高，MDA含量明顯降低（P<0.05，P<0.01）。6．半定量RT-PCR

7、分析，草甘膦損傷后支持細(xì)胞ABP mRNA、Vimentin RNA表達(dá)明顯減弱；經(jīng)過茶多酚40μg/ml、80μg/ml預(yù)處理12h后，支持細(xì)胞ABP mRNA、Vimentin RNA表達(dá)明顯增強(qiáng)(P<0.01)。
　　結(jié)論：①90μg/ml濃度的草甘膦染毒支持細(xì)胞24h，可明顯抑制支持細(xì)胞的活性。②茶多酚在10μg/ml～80μg/ml濃度范圍內(nèi)預(yù)處理支持細(xì)胞12h，對(duì)草甘膦造成的支持細(xì)胞損傷具有明顯的保護(hù)作用，且具有時(shí)間依