AMPK，CaMKⅡ和PKC在鈣信號(hào)調(diào)節(jié)骨骼肌細(xì)胞GLUT4胞吞和胞吐機(jī)制中的作用.pdf

1、目的:
　　本課題組前期發(fā)現(xiàn)鈣離子載體ionomycin升高骨骼肌細(xì)胞胞漿鈣離子濃度通過調(diào)節(jié)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子4(GLUT4)運(yùn)輸促進(jìn)葡萄糖吸收，ionomycin促進(jìn)GLUT4胞吐并抑制GLUT4胞吞，為明確詳細(xì)的信號(hào)機(jī)制，本課題探討AMPK、CaMKⅡ和PKC在ionomycin調(diào)節(jié)GLUT4胞吞和胞吐機(jī)制中的作用。
　　方法:
　　用終濃度為1μM的ionomycin孵育穩(wěn)定過表達(dá)GLUT4myc的L6-GLUT4my

2、c骨骼肌肌細(xì)胞，ELISA法檢測(cè)細(xì)胞膜表面GLUT4myc水平，western blot方法檢測(cè)不同蛋白的磷酸化水平、蛋白表達(dá)水平以及各種化學(xué)性蛋白酶抑制劑對(duì)蛋白磷酸化的影響。siRNA技術(shù)下調(diào)目的蛋白表達(dá)水平，研究5'-AMP激活蛋白激酶(AMPK)、依賴鈣調(diào)蛋白的蛋白激酶Ⅱ(calmoduling-dependent protein kinaseⅡ，CaMKⅡ)是否參與ionomycin調(diào)節(jié)的GLUT4myc胞吞和胞吐作用。采用傳統(tǒng)

3、型和新穎型PKC抑制劑G(o)6983和傳統(tǒng)型PKC抑制劑G(o)6976抑制PKC活性，檢測(cè)PKC是否參與ionomycin調(diào)節(jié)的GLUT4運(yùn)輸。
　　結(jié)果:
　　1μM鈣離子載體ionomycin孵育L6-GLUT4myc骨骼肌肌細(xì)胞5分鐘和10分鐘，磷酸化CaMKⅡ、AMPK和蛋白激酶C(PKCs)，但不影響蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)。用siRNA下調(diào)CaMKⅡδ的表達(dá)，抑制了ionomyc

4、in對(duì)GLUT4myc胞吐的調(diào)節(jié)作用，但不影響其對(duì)胞吞的作用，由此抑制了細(xì)胞表面GLUT4myc數(shù)量的增加。應(yīng)用AMPK小分子抑制劑Compound C，不影響ionomycin抑制的GLUT4myc胞吞作用。應(yīng)用CaMKK抑制劑STO-609，抑制了ionomycin刺激增加的GLUT4myc胞吐但不影響其對(duì)胞吞的抑制作用，由此降低了ionomycin增加細(xì)胞表面GLUT4myc的作用。傳統(tǒng)型和新穎型PKC抑制劑G(o)6983，抑制

5、了ionomycin升高細(xì)胞表面GLUT4myc的作用，并抑制ionomycin對(duì)PKC底物的磷酸化作用。
　　siRNA下調(diào)CaMKⅡδ的表達(dá)，抑制了ionomycin對(duì)CaMKⅡ T286的磷酸化作用，但不抑制ionomycin對(duì)AMPK T172的磷酸化作用。siRNA下調(diào)AMPK的表達(dá)，抑制了ionomycin對(duì)AMPK T172的磷酸化作用，但不降低ionomycin對(duì)CaMKⅡ T286磷酸化的作用倍數(shù)。CaMKK抑制

6、劑STO609，抑制對(duì)照組對(duì)CaMKⅡ T286的磷酸化作用，但不抑制ionomycin對(duì)CaMKⅡ T286磷酸化的作用倍數(shù)。PKC抑制劑G(o)6976（傳統(tǒng)型）和G(o)6983（傳統(tǒng)型和新穎型）不影響ionomycin對(duì)AMPK和CaMKⅡ的磷酸化作用。
　　結(jié)論:
　　1.Ionomycin升高AMPK、CaMKⅡ和PKC底物磷酸化水平。
　　2.CaMⅡδ參與ionomycin促進(jìn)GLUT4myc胞吐的作用

7、。
　　3.AMPK和CaMⅡδ不參與ionomycin抑制GLUT4myc胞吞的作用。
　　4.傳統(tǒng)型或新穎型PKC參與ionomycin調(diào)節(jié)的GLUT4myc運(yùn)輸。
　　5.下調(diào)CaMKⅡδ的表達(dá)，不影響ionomycin對(duì)AMPK的磷酸化作用。
　　6.下調(diào)AMPK的表達(dá)或STO609，不影響ionmycin對(duì)CaMKⅡ的磷酸化作用。
　　7.抑制PKC不影響ionomycin對(duì)CaMKⅡ和AMPK的