霍亂弧菌膽鹽外排相關(guān)基因篩選方法的建立及有氧生長(zhǎng)相關(guān)蛋白Sco1和C-signal的研究.pdf

1、霍亂是一種古老且流行廣泛的烈性腸道感染疾病，它是由革蘭氏陰性細(xì)菌霍亂弧菌所引起的。大量的研究表明，霍亂弧菌的致病能力主要是由霍亂毒素和毒素共調(diào)節(jié)菌毛引起的。
　　 膽鹽是膽汁的一部分，在人體內(nèi)能夠幫助消化脂肪。它也是一種去垢劑，能破壞細(xì)胞膜從而殺死細(xì)胞。霍亂弧菌能夠耐受一定濃度的膽鹽，說明它有某些基因能夠把膽鹽外排出細(xì)胞或是降解膽鹽。本實(shí)驗(yàn)采用轉(zhuǎn)座子隨機(jī)插入基因組的方法篩選到一株對(duì)粗膽鹽、膽酸鈉和脫氧膽酸鈉耐受能力顯著下降的霍亂

2、弧菌突變株，經(jīng)基因測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)此基因與文獻(xiàn)報(bào)道的霍亂弧菌膽鹽外排泵一致。說明這種利用轉(zhuǎn)座子隨機(jī)插入失活來篩選膽鹽外排相關(guān)基因的方法的建立是可行的，可以通過此體系篩選其他可能存在的膽鹽外排相關(guān)基因。
　　 細(xì)胞色素c氧化酶是電子傳遞鏈終端氧化酶，它從細(xì)胞色素c得到電子，并把氧氣還原成水。銅離子遞呈基因sco1編碼的Sco1蛋白在酵母、枯草芽孢桿菌等微生物中起到了把銅離子傳遞給細(xì)胞色素c氧化酶的銅離子氧化還原中心的作用。在霍亂弧菌中

3、vca0038為假設(shè)的sco1基因。本實(shí)通過框內(nèi)敲除的方法獲得該基因的缺失突變株后，霍亂弧菌突變株在LB液體培養(yǎng)基和M9液體培養(yǎng)基中有氧條件下生長(zhǎng)速度并未下降，細(xì)胞色素c氧化酶氧化能力和對(duì)過氧化氫的耐受能力也沒有下降。因此，推測(cè)該基因?qū)魜y弧菌的細(xì)胞色素c氧化酶氧化能力沒有影響。
　　 霍亂弧菌有三套群體感應(yīng)系統(tǒng):CqsA/S系統(tǒng)、LuxS/PQ系統(tǒng)和VarS/VarA-CsrA/BCD系統(tǒng)。它們對(duì)霍亂弧菌的毒力基因表達(dá)等調(diào)控作

4、用。群體感應(yīng)信號(hào)分子C-Signal在粘細(xì)菌Myxococcus xanthus有氧生長(zhǎng)時(shí)細(xì)胞聚集并形成孢子的過程中起作用。這提示在霍亂弧菌中，假設(shè)的C-signal合成基因vc1815的產(chǎn)物對(duì)霍亂弧菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)可能有所影響。本實(shí)驗(yàn)缺失該基因后，霍亂弧菌突變株的生物膜形成能力并未受明顯影響，其毒力共調(diào)節(jié)菌毛TCP的合成能力也未下降，在乳鼠腸道內(nèi)的定殖能力也未受到影響，推測(cè)該基因?qū)魜y弧菌群體感應(yīng)系統(tǒng)可能沒有影響。
　　 本實(shí)

5、驗(yàn)通過轉(zhuǎn)座子插入失活的方式構(gòu)建了霍亂弧菌膽鹽外排相關(guān)基因的篩選方法，并驗(yàn)證了該篩選方法是可行的。同時(shí)構(gòu)建了霍亂弧菌與有氧生長(zhǎng)相關(guān)的細(xì)胞色素c氧化酶基因vca0038和群體感應(yīng)信號(hào)分子C-signal合成基因vc1815的框內(nèi)敲除突變株。發(fā)現(xiàn)vca0038缺失突變株的有氧生長(zhǎng)以及細(xì)胞色素c氧化酶氧化能力未受明顯影響。而vc1815缺失突變株的生物膜形成等與群體感應(yīng)相關(guān)的性狀與野生型相比也無明顯差別，推測(cè)這兩個(gè)基因可能不影響霍亂弧菌有氧生長(zhǎng)