VEGF-PLGA納米微囊修飾BAMG支架修復重建組織工程尿道的實驗研究.pdf

1、由于缺乏合適的應用于臨床的替代材料，泌尿道的修復與重建一直是臨床上比較棘手的難題。其中，尿道狹窄多由外傷、炎癥、先天性尿道下裂及腫瘤等原因引起，既往多采用膀胱黏膜、包皮皮瓣、口腔黏膜等自體組織進行修復重建，但由于存在供區(qū)再次損傷，取材有限，易導致感染、尿瘺、尿道再狹窄、尿道憩室等并發(fā)癥。因此，研究者嘗試利用組織工程技術(shù)再造尿道上皮復合材料進行尿道重建。但復合材料回值體內(nèi)易出現(xiàn)種子細胞凋亡、材料降解引起局部炎癥反應，回植材料缺乏血供，導致

2、組織纖維化增生，瘢痕形成，限制了其在臨床上的進一步應用。納米微囊技術(shù)具有緩釋、保護負載蛋白活性等優(yōu)點，PLGA是經(jīng)美國FDA批準廣泛應用于臨床的高分子材料，VEGF能夠特異性的刺激血管內(nèi)皮細胞的增殖及新生血管的形成，增加血管的通透性，為替代組織提供良好地微環(huán)境。因此VEGF-PLGA納米微囊為組織工程材料再血管化提供了一種新的思路和技術(shù)可能。本實驗通過制備VEGF-PLGA納米微囊，并考察其體外、體內(nèi)的緩釋性能，并與BMGA交聯(lián)后復合口

3、腔上皮細胞進行尿道修復重建，為尿道修復重建組織工程再血管化提供實驗依據(jù)。
　　第一章納米微球的制備與性能評估
　　1、目的
　　優(yōu)化納米微球的制備工藝，評估其性能參數(shù)。
　　2、材料和方法
　　以PLGA為載體材料，采用乳化-溶劑揮發(fā)法制備芯材藥物（諾氟沙星）微球，以包封率、載藥量、粒徑及其分布等為評價指標，對諾氟沙星微球的處方和工藝因素進行單因素考察，在此基礎(chǔ)上通過正交設計篩選出最優(yōu)處方。對優(yōu)選處方制得的

4、諾氟沙星微球的外觀形態(tài)、納米微球粒徑、包封率、載藥量進行考察研究和評價。對最優(yōu)處方制備的諾氟沙星PLGA微球進行體外釋放研究，考察不同釋放介質(zhì)、不同釋放條件下的體外釋放情況，評價制備所得微球的體外緩釋效果。
　　3、結(jié)果
　　建立了紫外分光光度計法測定諾氟沙星的標準曲線，用于諾氟沙星原料藥相關(guān)性質(zhì)及穩(wěn)定性考察和微球制劑載藥量、包封率的測定。處方前研究工作結(jié)果顯示25℃時諾氟沙星在水中的平衡溶解度為10mg/mL。諾氟沙星的丙

5、酮:水(1:9)溶液7天內(nèi)穩(wěn)定。通過單因素試驗考察和正交試驗對諾氟沙星PLGA微球的制備工藝和處方進行了優(yōu)化，最優(yōu)條件下制得的諾氟沙星PLGA微球樣品的載藥量為2.00±0.10％、包封率為98.98±2.75％。電子掃描顯微鏡進行觀察，微球大小均勻，顆粒圓整，表面光滑。通過紫外分光光度計法用于微球體外釋藥的測定;建立了微球的體外釋藥標準曲線，確定了以37℃生理鹽水溶液為釋放介質(zhì)的透析法進行制劑體外釋放的測定。體外釋放的結(jié)果表明諾氟沙星

6、微球在體外釋放條件下無明顯突釋效應，具有緩釋效果，體外釋放時間可以持續(xù)達到30天。
　　4、結(jié)論
　　本文通過乳化-溶劑揮發(fā)法制備理想的PLGA納米微球，其制備方法可操作性好，獲取量滿意，符合本課題前期要求。通過正交優(yōu)化實驗研究掌握了諾氟沙星納米微球的部分理化性質(zhì)，為微球的制備提供了支持。通過處方優(yōu)化制備的諾氟沙星PLGA納米微球具有理想的載藥量，較高的包封率和明顯的體外緩釋效果，達到下一步包裹蛋白活性芯材的技術(shù)要求。

7、>　　第二章VEGF-PLGA納米微囊的制備及體外緩釋實驗
　　1、目的
　　探討雙乳化-溶劑揮發(fā)法制備VEGF-PLGA納米微囊的制備及體外緩釋實驗
　　2、材料和方法
　　以PLGA為載體材料，采用雙乳化-溶劑揮發(fā)法制備芯材為活性生長因子的納米微囊，以包封率、載藥量、粒徑等為評價指標，通過前期納米微球的實驗基礎(chǔ)，通過正交設計篩選出最優(yōu)處方。對優(yōu)選處方制得的VEGF-PLGA納米微囊的外觀形態(tài)、納米微囊粒徑、包

8、封率、載藥量進行考察研究和評價。并對最優(yōu)處方制備的VEGF-PLGA微囊進行體外釋放研究，評價制備所得微球的體外緩釋效果。
　　3、結(jié)果
　　通過單因素試驗考察和正交試驗對VEGF-PLGA微球的制備工藝和處方進行了優(yōu)化，最優(yōu)條件下制得的VEGF-PLGA納米微囊樣品。負染電子掃描顯微鏡進行觀察，微球大小均勻，顆粒圓潤。采用紫外分光光度計法用于納米微囊體外釋藥的測定;確定了以37℃生理鹽水溶液為釋放介質(zhì)的透析法進行制劑體外釋

9、放的測定，建立了其體外釋藥標準曲線。體外釋放的結(jié)果表明VEGF-PLGA在體外釋放條件下無明顯突釋效應，具有緩釋效果，體外釋放時間可以持續(xù)達到15天。
　　4、結(jié)論
　　本文通過雙乳化-溶劑揮發(fā)法制備包裹VEGF的PLGA納米微囊。通過單因素試驗及正交優(yōu)化試驗探索乳化能量、乳化時間等因素對納米微囊的影響。通過處方優(yōu)化制備的VEGF-PLGA微囊具有良好的載藥量，較高的包封率和理想的體外緩釋效果，可滿足植入替代組織局部持續(xù)緩釋

10、VEGF的要求。并為本實驗進一步的開展，將VEGF-PLGA納米微囊修飾支架材料應用于尿道重建的研究提供了前期實驗基礎(chǔ)。
　　第三章VEGF-PLGA納米微囊修飾BAMG支架的試驗研究
　　1、目的
　　包裹VEGF的PLGA納米微囊修飾BAMG支架，并以口腔黏膜上皮細胞為種子細胞與支架材料復合進行細胞相容性試驗。
　　2、材料和方法
　　采用不同的方法將前期制備的VEGF-PLGA納米微囊與我實驗室制備的

11、BAMG支架進行復合，尋求最佳的納米微囊與支架材料交聯(lián)方法，并將修飾過的支架材料與口腔黏膜上皮細胞進行共培養(yǎng)，驗證其細胞相容性及與細胞的復合能力。
　　3、結(jié)果
　　經(jīng)過不同交聯(lián)方式對比，VEGF-PLGA與BAMG支架交聯(lián)良好，增加了支架材料的比表面積程度，其孔隙率不變，使細胞更易于黏附、生長，四唑鹽比色法(MTT)、流式細胞儀檢測及掃描電子顯微鏡觀察，顯示細胞活性、生長增殖良好。
　　4、結(jié)論
　　實驗證明包

12、裹VEGF的新型PLGA納米微囊修飾支架效果良好，增加了支架材料的表面粗糙度及比表面積，易于口腔黏膜上皮細胞黏附更適合其作為種子細胞在支架材料上的貼附、生長、增殖和分化，為本實驗體內(nèi)部分的進一步開展提供了堅實的前期基礎(chǔ)。
　　第四章口腔黏膜上皮細胞復合VEGF-PLGA修飾的BAMG支架重建組織工程尿道的研究
　　1、目的
　　探討口腔黏膜上皮細胞作為尿路上皮細胞的替代種子細胞，種植于包裹VEGF的PLGA納米微囊修飾

13、的BAMG支架回植于兔模型組織工程尿道修復重建的研究。
　　2、方法
　　將前期制備的VEGF-PLGA納米微囊交聯(lián)于BAMG支架，與口腔黏膜上皮細胞復合，并分組進行兔模型的前尿道補片式替代重建手術(shù)（A組:單純BAMG支架修復重建尿道組;B組:空白PLGA納米微囊修飾的BAMG支架修復重建組;C組:包裹VEGF的PLGA納米微囊修飾的BAMG支架修復重建組），每組分別術(shù)后1周，2周、1月、2月、3月行尿道造影，并處死后取替代

14、段組織行包括大體標本觀測，及HE、masson、免疫組化等相關(guān)組織學檢測。
　　3、結(jié)果
　　兔模型尿道重建術(shù)后，尿道造影顯示單純BAMGgroup，空白PLGA修飾BAMGgroup術(shù)后均出現(xiàn)不同程度狹窄;空白PLGA修飾BAMG組術(shù)后2周出現(xiàn)輕度尿道狹窄，術(shù)后1月、3月尿道造影顯示比術(shù)后2周尿道狹窄有所緩解，VEGF-PLGA納米微囊修飾BAMG組尿道造影顯示尿道通暢。大體標本觀測顯示單純BAMG組、空白PLGA/BAM

15、G組尿道組織替代段局部疤痕明顯;VEGF-PLGA納米微囊修飾BAMG組術(shù)后2周出現(xiàn)輕度局部黏膜攣縮，術(shù)后2周、1月替代段攣縮較前明顯減輕，于術(shù)后2月、3月觀測，替代段尿道于正常尿道無明顯差別。HE、masson及免疫組化組織學檢測單純BAMG組及空白PLGA納米微囊修飾BAMG組術(shù)后2周即出現(xiàn)組織纖維化、膠原蛋白大量沉著、膠原蛋白排列紊亂，空白PLGA納米微囊修飾BAMG組較單純支架組膠原蛋白沉積少;VEGF-PLGA修飾BAMG支架

16、組少量膠原蛋白沉著，替代組織可見大量新生微血管生成，尿道管腔面細胞生長良好。
　　4、結(jié)論
　　VEGF-PLGA納米微囊修飾的BAMG支架與口腔黏膜細胞復合后進行兔模型尿道修復重建，術(shù)后通過尿道造影、大體標本觀察，組織學等系列檢測，證明對比單純BAMG回植，及空白PLGA納米微囊修飾的BAMG回植，VEFG-PLGA納米微囊修飾的BAMG組能夠在替代組織局部形成新生血管，明顯減少組織纖維化，在一定程度上減輕尿道重建段的疤痕