應用組織工程技術構建立體尿道的實驗研究.pdf

1、目的:探索兔陰莖海綿體平滑肌(CCSMCs)細胞的純化培養(yǎng)技術及純度鑒定方法。
　　 方法：取雄性新西蘭兔新鮮的陰莖組織,利用高濃度的膠原酶消化法結合差速貼壁技術對海綿體平滑肌細胞進行純化培養(yǎng)。獲得CCSMCs后運用MTT分析細胞生長特性,平滑肌肌動蛋白(α-SM-actin)、肌球蛋白(Myosin)、結蛋白(Desmin)免疫熒光鑒定海綿體平滑肌細胞。同期兔脂肪干細胞作為對照參考。流式細胞儀檢測P2及P5代細胞α-SM-ac

2、tin、Myosin、Desmin陽性率變化情況。
　　 結果：培養(yǎng)細胞MTT顯示細胞指數(shù)增長期為6天左右,隨后進入平臺期。α-SM-actin、Myosin、Desmin均呈陽性反應,同期脂肪干細胞僅α-SM-actin顯示陽性結果。第2代細胞表達α-SM-actin、Myosin、Desmin陽性率分別65.3％,42.2％,62.3％。通過純化技術至第5代時,上述指標陽性表達率分別上升為92.8％,72.7％,78.1％.

3、
　　 結論：通過高濃度的酶消化法及差速貼壁技術可獲得高純度的陰莖海綿體平滑肌細胞,完全符合組織工程及其它基礎研究的要求。而Myosin、Desmin相對于α-SM-actin更應成為鑒定CCSMCs的特異性指標。
　　 第二部分
　　 目的:評估應用于尿道修復重建的多種生物材料的力學特性及生物相容性。
　　 方法：脫細胞法制備小腸黏膜下層組織(SIS),膀胱脫細胞基質(BAMG)以及脫細胞尿道海綿體(A

4、CSM),同時編織法制備PGA支架。單軸拉伸測試測定各類支架生物力學特性,光鏡及掃描電鏡法測定支架表面孔徑大小。線粒體代謝活性法(MTT)檢測各種生物材料的細胞毒性。所有支架表面接種海綿體平滑肌細胞(CCSMCs),體外培養(yǎng)14天后進一步評估細胞滲透情況。
　　 結果：生物力學評估顯示ACSM在彈性模量以及斷裂強度方面的檢測結果明顯由于其余材料(p<0.05).MTT的結果顯示所有的支架材料均支持正常的細胞生長代謝,并未發(fā)現(xiàn)存在

5、有明顯的細胞毒性。PGA在掃描電鏡中顯示出最大的孔徑(>200μm).同時ACSM的尿道面(<5μm)和海綿體面(>10μm)觀察到明顯不同的孔徑大小。細胞接種14天以后PGA材料的內部可見種子細胞的廣泛分布。在BAMG以及ACSM的尿道面可見有多層的上皮細胞層的形成,但沒有發(fā)現(xiàn)有明顯的細胞滲透跡象。而SIS和ACSM的海綿體面觀察到明顯的細胞滲透生長表現(xiàn)。
　　 結論：所有支架材料在本研究中顯示出良好的生物相容性,同時在力學特

6、性方面也與正常尿道組織相仿。但ACSM在力學和組織學的諸多參數(shù)上具有一定的優(yōu)越性,其可在將來成為組織工程尿道修復重建材料的新選擇之一。
　　 第三部分
　　 目的:探討及優(yōu)化體外構建三維立體尿道組織的復合技術。
　　 方法：高速振蕩脫細胞法制備脫細胞尿道海綿體(ACSM),碘消毒法進行復合前消毒,酶消化法分離及擴增兔舌黏膜上皮細胞和海綿體平滑肌細胞。采用三種復合技術進行細胞與支架材料的復合:A組(三明治復合組)、

7、B組(注射復合組)、C組(動態(tài)復合組)。體外培養(yǎng)14天以后行HE染色以檢查復合效果。
　　 結果：振蕩脫細胞處理后ACSM的結構較脫細胞前更為疏松；碘消毒法在徹底消毒的同時能夠最大限度的保留脫細胞支架的原有結構。復合支架體外培養(yǎng)14天后HE染色均可見有完整的上皮細胞層形成于支架表面。A組復合后平滑肌細胞僅在支架大間隙中可見,未見向深部浸潤趨勢。B組復合后平滑肌細胞成團分布于支架內,并受周圍支架組織約束成局限化表現(xiàn)。C組HE染色可

8、見平滑肌細胞均勻分布于支架內部并與支架表面的上皮細胞層分界清晰。
　　 結論：高速振蕩法制備的支架組織具有理想的三維空間結構,結合動態(tài)細胞復合技術可構建擁有良好立體結構的尿道組織。
　　 第四部分
　　 目的:探討構建三維立體尿道以及利用其進行尿道修復重建可行性
　　 方法：制備脫細胞尿道海綿體支架(Acellular corpus spongiosummatrices,ACSM),并利用單軸力學拉伸測試

9、進行相關的生物力學特性檢測。采用動一靜態(tài)復合技術將實驗兔自體海綿體平滑肌細胞(CCSMCs)以及舌黏膜上皮細胞接種于ACSM上。體外培養(yǎng)14天后6只實驗兔采用上述材料進行尿道缺損模型的修補(C組),另6只實驗兔采用單純復合舌黏膜上皮細胞的支架進行尿道重建(B組),剩余6只實驗兔作為對照組接受單純支架材料的尿道重建(A組)。實驗兔分別于術后1、2、6月處死,處死前均接受逆行尿道造影的評估,同時進行H&E染色以及相關免疫組化染色研究。

10、>　　 結果：ACSM在力學檢測過程中體現(xiàn)出優(yōu)于正常尿道組織的生物力學特性(p<0.05)。經(jīng)過14天體外培養(yǎng)后,復合支架表面可以見到有1-2層上皮細胞生長,同時CCSMCs可以見到分布于支架材料的內部。動物回植實驗中,C組的實驗兔在研究的全過程中始終保持著管腔的通暢,但在A和B組中發(fā)現(xiàn)明顯的尿道狹窄跡象。組織學研究中A組實驗兔在6月時所獲取的尿道可以很清晰看見有明顯的纖維化以及炎癥反應。在B組的切片觀察中僅可見層數(shù)極少的上皮細胞層形