兩種豬源病毒基因圖譜繪制及分子免疫研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS)和豬2型圓環(huán)病毒(Porcinecircovirustype2，PCV2)病是當(dāng)今養(yǎng)豬業(yè)嚴(yán)重關(guān)切的兩種重大傳染病之一，兩病的廣泛流行和蔓延已給世界各國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展造成了嚴(yán)重威脅和經(jīng)濟(jì)損失。在現(xiàn)代化規(guī)模養(yǎng)豬場(chǎng)中，PCV2與PRRSV往往混合感染，發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。為了有效控制這兩種傳染病的流行，減少由此引起的經(jīng)濟(jì)損失，本研究以

2、PCV2和PRRSV當(dāng)?shù)亓餍卸局隇檠芯坎牧?，進(jìn)行了基因克隆、分子結(jié)構(gòu)特征分析、基因圖譜繪制、分子診斷、流行病學(xué)調(diào)查及免疫研究，主要研究成果如下： (1)應(yīng)用RT-PCR技術(shù)，分段克隆了PRRSVGS株基因，采用DNAStar軟件將各基因依次拼接，并對(duì)其特征進(jìn)行了分析，繪制了PRRSVGS株全基因圖譜和系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果表明，該毒株全基因組長(zhǎng)15427bp，包含8個(gè)閱讀框(ORF)，其中5’端非編碼區(qū)長(zhǎng)190bp，與國(guó)內(nèi)外參考毒株核

3、苷酸序列的同源性分別為56.3﹪～97.9﹪；ORF1長(zhǎng)11882，其中0RF1a長(zhǎng)7512bp，與國(guó)內(nèi)外參考毒株核苷酸及推導(dǎo)氨基酸序列同源性分別為54.3﹪～98.7﹪和49﹪～99.3﹪，ORF1b長(zhǎng)4374bp，與國(guó)內(nèi)外參考毒株核苷酸及推導(dǎo)氨基酸序列同源性分別為60.8﹪～95.5﹪和49﹪～99.3﹪；結(jié)構(gòu)蛋白基因長(zhǎng)約3819bp，分為6個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白基因區(qū)，與BJ-4、CH-1a、HB-2(sh)/2002和VR-2332美洲株等

4、核苷酸的同源性分別為：ORF293.1﹪～96.6﹪，ORF390.7﹪～96.5﹪，ORF488.1﹪～95.5﹪，ORF587.9﹪～95.0﹪，ORF695.1﹪～97.1﹪，ORF792.2﹪～95.7﹪，推導(dǎo)的氨基酸同源性分別為：ORF291.1﹪～95.7﹪，ORF389.4﹪～92.5﹪，ORF488.3﹪～96.6﹪，ORF587.1﹪～95.0﹪，ORF696﹪～97.1﹪，ORF790.3﹪～95.2﹪；3’端非編碼

5、區(qū)長(zhǎng)151bp，與國(guó)內(nèi)外參考毒株核苷酸序列的同源性分別為70.9﹪～100﹪；最后有一個(gè)長(zhǎng)14個(gè)堿基的poly(A)尾。從系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，PRRSVGS株同以LV株為代表的歐洲型遺傳距離較遠(yuǎn)，而與以VR-2332株為代表的北美洲型和流行于我國(guó)的毒株遺傳距離較近，進(jìn)一步證實(shí)了流行于我國(guó)的毒株在基因型上屬于北美洲型。 (2)構(gòu)建了PRRSVGS株E基因的重組腺病毒質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染AD-293細(xì)胞，經(jīng)熒光檢測(cè)表明獲得了AD-E復(fù)制缺陷型腺病

6、毒。用重組腺病毒AD-E免疫小鼠，以間接ELISA和MTT法檢測(cè)小鼠血清抗體水平和T淋巴細(xì)胞增殖情況，結(jié)果能刺激T淋巴細(xì)胞增殖，但未能檢測(cè)到小鼠血清中的抗體，其原因有待進(jìn)一步研究。 (3)應(yīng)用PCR技術(shù)對(duì)從甘肅豬場(chǎng)分離的3株P(guān)CV2毒株進(jìn)行了全序列測(cè)定，其中PCV2Ww株基因組長(zhǎng)度為1768bp，PCV2LZ和TS株長(zhǎng)1767bp，將序列登陸到Genbank獲得3個(gè)登錄號(hào)DQ322701、DQ363860和DQ355153，繪制

7、了PCV2基因圖譜和系統(tǒng)進(jìn)化樹。3株之間的全基因組核苷酸同源性為96.4﹪～99.4﹪，而主要閱讀框ORF1的核苷酸及氨基酸之間的同源性分別為99.2﹪～99.8﹪和99.0﹪～99.4﹪，說(shuō)明ORF1非常保守，這與其編碼蛋白的功能有關(guān)；而閱讀框ORF2的核苷酸及氨基酸之間的同源性分別為92.6﹪～99﹪和92.7﹪～98.7﹪，變異相對(duì)于ORF1較大；3株之中LZ株和Ww株之間同源性較高，而與TS株相對(duì)較遠(yuǎn)。從系統(tǒng)進(jìn)化樹上分析，目前我

8、國(guó)分離的毒株比較復(fù)雜，有的來(lái)源于歐洲，有的來(lái)源于北美洲，本研究分離的3株皆屬于歐洲型。另外，本研究還建立了PCV2的PCR檢測(cè)方法，應(yīng)用該方法對(duì)甘肅部分豬場(chǎng)PCV2的發(fā)病情況進(jìn)行了調(diào)查，結(jié)果感染率為74.1﹪，證明甘肅豬場(chǎng)普遍存在有PCV2感染。 (4)構(gòu)建了PCV2Ww株Cap基因與豬α-IFN基因的真核表達(dá)載體pIRES-Cap-α-IFN，用該質(zhì)粒免疫小鼠，以間接ELISA和MTT法檢測(cè)小鼠血清抗體水平和T淋巴細(xì)胞增殖情況