VEGF-A，C，D作為惡性漿膜臉積液診斷、預后及療效預測標志物的研究.pdf

1、肺癌、乳腺癌和惡性淋巴瘤是導致惡性胸腔積液的前3位病因，一旦出現(xiàn)了惡性胸腔積液，患者平均生存期往往不到6個月。惡性腹腔積液最常見于消化道腫瘤和婦科腫瘤，一旦腫瘤患者出現(xiàn)了惡性腹腔積液，即預示中位生存期不足20周，尤其以消化道腫瘤引起的惡性腹腔積液預后最差，生存期僅12-20周。心包積液一般為患者臨終前表現(xiàn)，預后更差。惡性漿膜腔積液的治療常常是臨床上的一個難題和挑戰(zhàn)。目前惡性漿膜腔積液的常規(guī)治療主要是利尿、限鹽、漿膜腔穿刺抽液術、腔內化療

2、，生物反應調節(jié)劑，中藥，熱療等，但療效均不理想，治療后腔內積液往往減少不明顯、復發(fā)較快，同時幾乎所有治療都有不同程度的毒副反應。研究表明:腫瘤浸潤或轉移至胸腹膜后，血管內皮生長因子VEGF(Vascularendothelial growth factor)水平的升高、腫瘤新生血管的生成以及血管通透性增加是漿膜腔內積液形成的重要機制。VEGF家族包括6種類型:VEGF-A、B、C、D、E和胎盤生長因子PIGF(placental gro

3、wth factor)，主要由腫瘤細胞和巨噬細胞分泌，VEGF-A是腫瘤血管生成中最重要的調控因子，VEGF-C和VEGF-D是腫瘤淋巴管生成中最重要的調控因子。應用血管生成抑制劑，特別是靶向VEGF的藥物，已經(jīng)成為基礎和臨床研究的熱點。目前對漿膜腔積液中VEGF的研究主要集中于代表血管生成的VEGF-A研究，代表淋巴管生成的VEGF-C，VEGF-D研究甚少。國產(chǎn)一類創(chuàng)新藥物重組人血管內皮抑素(rh-endostatin，商品名end

4、ostar，恩度)是一種人源化廣譜的抗血管生成藥物，可以下調多種促血管生成因子對血管內皮的保護作用，直接作用靶點為血管內皮細胞，發(fā)揮直接和間接抗血管作用。近年來，有多位學者探索應用恩度單藥或者聯(lián)合化療藥物治療惡性漿膜腔積液，結果發(fā)現(xiàn)，這種方法高效低毒，控制積液作用強，耐受性高，并能明顯地改善患者的生活質量。但是恩度等血管生成抑制劑的療效評價體系、探索針對性的分子標志物來預測恩度的療效，還有大量的工作需要人們去做。如何完善并利用分子標記物

5、來指導惡性漿膜腔積液的臨床診斷、預后、預測其療效、優(yōu)化其治療是未來工作的方向。本研究通過檢測原發(fā)于肺癌及胃癌的惡性漿膜腔積液上清及細胞水平的VEGF-A，C，D的蛋白含量及表達，探究三因子在惡性漿膜腔積液診斷，預后及恩度療效預測的臨床價值。并建立了穩(wěn)定整合熒光素酶(luciferase)的胃癌未分化NUGC-4-luc細胞系，并以該細胞系為基礎，建立胃癌裸鼠腹水瘤模型，結合生物發(fā)光活體成像(in vivo bioluminescent

6、imaging system)動態(tài)監(jiān)測腹水癌細胞的變化，并檢測腹膜結節(jié)微血管密度MVD(microvesseldensity)、淋巴管密度LVD(lymphatic vessel density)的數(shù)量，綜合評價分子標志物VEGF-A，C，D在惡性漿膜腔積液靶向治療中的價值。
　　第一部分 VEGF-A，C，D在惡性漿膜腔積液中診斷及預后的臨床意義
　　目的:評價VEGF-A，C，D在惡性漿膜腔積液中診斷，預后的臨床價值，尋

7、找合適的檢測水平，為局部抗血管抗淋巴管治療提供依據(jù)。
　　方法:應用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA enzyme-linked immunosorbentassay)方法檢測漿膜腔積液患者外周血清79例（肺癌30例，胃癌21例，良性積液28例），積液上清96例（肺癌38例，胃癌30例，良性積液28例）VEGF-A，C，D的蛋白含量;免疫細胞化學方法(ICCimmunocytochemistry)檢測積液細胞水平71例（肺癌34例，胃

8、癌17例，良性積液20例）VEGF-A，C，D的蛋白表達，通過SPSS17.0分析其診斷，預后，臨床病理因素及其相關性的臨床意義。
　　結果:
　　1、VEGF-A
　　1.1 VEGF-A含量及表達:血清sVEGF-A含量在癌組及良性組無統(tǒng)計學差別（p＞0.05）。積液上清pVEGF-A含量在肺癌及胃癌組均高于良性積液組（p＜0.05），且pVEGF-A的升高在肺癌組和胃癌組間無差別（p＞0.05）。pVEGF-A與

9、sVEGF-A含量在良性積液組相近，但在惡性積液中顯示pVEGF-A明顯高于sVEGF-A水平(p＜0.05)。20例良性積液未見癌細胞，染色部位主要位于間皮細胞胞漿，淋巴細胞及粒細胞均未著色。細胞水平(cVEGF-A)在51例惡性積液患者中表達率為52.94％，均主要表達于癌細胞的胞漿。
　　1.2 VEGF-A與臨床病理因素聯(lián)系:pVEGF-A與年齡呈負相關，與惡性積液，血性積液及單發(fā)胸腹膜轉移成正相關(p＜0.05)。cVE

10、GF-A與年齡呈負相關，回歸系數(shù)B為0.340(p＜0.05)。
　　1.3血清sVEGF-A，積液上清pVEGF-A與生存關系:以惡性積液患者血清及上清三指標含量的中位值為臨界值，分為高含量及低含量組，對比其1年生存率情況。 pVEGF-A水平＞406.19pg/ml較pVEGF-A≤406.19pg/ml患者1年生存期短，統(tǒng)計學差異處于邊緣值(p=0.066)。 sVEGF-A水平未顯示1年生存差別（p＞0.05）。
　

11、　2、VEGF-C，VEGF-D
　　2.1 VEGF-C，VEGF-D的含量及表達:血清sVEGF-C，sVEGF-D含量在癌組及良性組無統(tǒng)計學差別（p＞0.05）。積液上清pVEGF-C，pVEGF-D含量在癌組及良性組無統(tǒng)計學差別（p＞0.05）。細胞水平cVEGF-C，cVEGF-D在51例惡性患者中表達率分別為70.58％和82.35％，均主要表達與癌細胞的胞漿。cVEGF-D在肺癌及胃癌惡性漿膜腔積液中的陽性表達，尤其

12、是強陽性表達明顯高于cVEGF-A，cVEGF-C(p＜0.05)。cVEGF-A，C，D在惡性漿膜腔積液中肺癌組與胃癌組無病種差別（p＞0.05）。
　　2.2 VEGF-C，VEGF-D與臨床病理因素聯(lián)系:pVEGF-C與年齡呈負相關（p＜0.05）。pVEGF-D與年齡正相關，與惡性積液及單發(fā)漿膜轉移成負相關（p＜0.05）。sVEGF-C，sVEGF-D蛋白水平與臨床病理因素無相關。cVEGF-C，cVEGF-D蛋白表達與

13、臨床病理因素無相關。
　　2.3血清sVEGF-C，sVEGF-D，積液上清pVEGF-C，pVEGF-D與生存關系:上清pVEGF-C，pVEGF-D，及血清sVEGF-C，sVEGF-D水平均未顯示1年生存差別（p＞0.05）。
　　結論:
　　1、積液上清VEGF-A在良惡性積液有差異，提示可能成為良惡性積液的腫瘤標志物。上清VEGF-A在1年生存預后中達到統(tǒng)計學邊緣值，需引起重視，需擴大樣本量及延長隨訪時間進一

14、步探討其預后價值。
　　2、積液上清及細胞水平VEGF-A與年齡呈負相關，提示隨年齡增長，VEGF-A水平下降;積液上清VEGF-A在惡性、血性積液及單發(fā)漿膜轉移中，含量高于良性、非血性及非單發(fā)漿膜轉移患者。
　　3、積液上清VEGF-C，VEGF-D在良惡性診斷方面無統(tǒng)計學差異，在癌細胞水平卻高表達。臨床需擴大良性積液樣本，進行病種分層后進一步研究其積液上清的診斷價值。
　　4、血清VEGF-A，C，D水平在漿膜腔積

15、液診斷及預后中均無明顯臨床意義，亦與臨床病理因素無明顯關聯(lián)。提示血清學標志物在漿膜腔積液的診斷預后價值可能不及局部標志物。
　　第二部分 VEGF-A，C，D在恩度治療惡性漿膜腔積液中療效預測的臨床意義
　　目的:評價VEGF-A，C，D在恩度治療惡性漿膜腔積液中的療效預測價值。
　　方法:應用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)方法檢測，20對惡性漿膜腔積液患者恩度腔內治療前后，積液上清VEGF-A，C，D蛋白含量，通過S

16、PSS17.0分析以上三因子在恩度療效預測中的價值。
　　結果:
　　1、局部漿膜腔單藥恩度組，局部漿膜腔恩度聯(lián)合順鉑組及局部恩度聯(lián)合全身抗腫瘤治療組，在客觀有效率RR(CR+PR)，臨床獲益率DCR(CR+PR+SD)及局部進展PD方面均未見明顯差異，(p＞0.05)。
　　2、積液上清VEGF-A，C，D蛋白含量與療效的關系:以療效評價指標RR，SD，PD進行分組:三因子治療前后變化差值(d0-d7)及治療前后變化

17、差值比(d0-d7/d0)，在RR，SD，PD組間均未達到統(tǒng)計學差別，p＞0.05，其中上清VEGF-A差值比（d0-d7/d0）組間p=0.085。
　　3、積液上清VEGF-A，C，D蛋白含量在治療組間的差別:積液上清VEGF-A，C，D的治療前后變化差值比（d0-d7/d0）在三治療組間無明顯統(tǒng)計學差異(p＞0.05)。
　　結論:
　　1、積液上清VEGF-A，C，D的治療前后變化差值(d0-d7)及治療前后變

18、化差值比(d0-d7/d0)在RR，NC，PD組間均無統(tǒng)計學差別，提示以上三因子尚不能預測局部恩度療效。
　　2、積液上清VEGF-A，C，D治療前后變化差值比（d0-d7/d0）在恩度不同治療組間無統(tǒng)計學差別，提示以上三因子尚不能指導臨床選擇不同的藥物治療方式。
　　第三部分 VEGF-A，C，D在恩度不同給藥方式治療胃癌腹水瘤模型中的研究
　　目的:結合癌細胞監(jiān)測及血管、淋巴管內皮標記，綜合評價分子標志物VEGF-

19、A，C，D在胃癌腹水瘤模型中的價值;探討恩度順鉑不同給藥方式的療效。
　　方法:培養(yǎng)NUGC-4-luc細胞(RPMI1640培養(yǎng)基+10％FBS+1％ P/S)，取5X106數(shù)量級細胞在0.5 ml PBS中，腹腔接種28只雌性裸鼠，接種后每周行動物生物發(fā)光活體成像。接種一周后隨機分組:Group1:順鉑(1mg/kg)d1-3+恩度(8mg/kg)d4-7; Group2:恩度(8mg/kg) d1-4+順鉑(1 mg/kg)

20、d5-7; Group3:恩度(8mg/kg)+順鉑(1mg/kg)d1，4，7;Group4即對照組:生理鹽水50 ul d1-7，均腹腔給藥，連用2周（每周成像一次），停藥觀察一周成像后處死。處死后取腹水上清，應用ELISA方法，檢測積液上清VEGF-A，C，D蛋白含量;腹膜結節(jié)包被蠟塊后，HE確認癌細胞，應用IHC方法，檢測VEGF-A，C，D及MVD，LVD。動物發(fā)光數(shù)據(jù)先經(jīng)IVIS系統(tǒng)處理，后通過SPSS17.0，分析其活體成

21、像，VEGF-A，C，D蛋白表達及含量，LVD，MVD數(shù)量在四個治療組間的差別。
　　結果:
　　1、成瘤情況
　　5×106數(shù)量級NUGC-4-luc細胞接種于裸鼠腹腔。7天后，據(jù)測量的癌細胞光子數(shù)進行分組，四組無明顯統(tǒng)計學差異(p＞0.05)。Group2中1只動物在用藥后第18天意外死亡。裸鼠用藥后隔日測量四組小鼠的體重并記錄，繪制小鼠體重變化曲線，4組無明顯區(qū)別(p＞0.05)。裸鼠處死后顯示血性腹水明顯，腹膜

22、細小結節(jié)多而廣泛。
　　2、用藥療效
　　2.1四組腹水量(ml):Group4（4.87±0.45）＞Group1（3.1±0.53）＞Group2(2.0±0.08)＞Group3(1.8±0.16)。
　　2.2四組腹膜結節(jié)數(shù)量:Group4（33.75±2.5）＞Group2(21.66±5.77)＞ Group3(18.75±2.5)＞Group1(8.75±4.78)。
　　2.3癌細胞光子數(shù)

23、　　據(jù)每次測量的癌細胞光子數(shù)繪制腫瘤的生長曲線，結果經(jīng)統(tǒng)計分析后顯示，在第1天及第8天四治療組無明顯區(qū)別，p＞0.05。第15天及21天時顯示，Group1，Group2，Group3均優(yōu)于Group4，p＜0.01。其中第15天時（用藥后2周），恩度聯(lián)合順鉑組(Group3)及順鉑序貫恩度組(Group1)均優(yōu)于恩度序貫順鉑組(Group2)，p＜0.05;但Group3與Group1無明顯區(qū)別，p＞0.05。第21天時（用藥后2周，

24、觀察1周），Group3仍優(yōu)于Group2，p＜0.05。
　　2.4腹膜結節(jié)MVD，LVD數(shù)量
　　D2-40和CD34以染成棕黑色管腔的判定為淋巴管及血管。MVD在四組間有差異(p＜0.01)，經(jīng)過兩兩比較，MVD數(shù)量Group4＞Group1＞Group2(p＜0.01)，Group2與Group3無差別(p＞0.05)。而LVD數(shù)量在四組之間無統(tǒng)計學差別(p＞0.05)。
　　3、VEGF-A，C，D的蛋白含量

25、及表達
　　3.1腹水上清VEGF-A，C，D的蛋白含量:上清VEGF-A在四組有差別(p＜0.05);經(jīng)過兩兩比較，四組均有差別(p＜0.05)，VEGF-A蛋白含量在Group4＞ Group1＞Group2＞ Group3。而腹水上清VEGF-C，VEGF-D的蛋白含量在四組間無明顯差別(p＞0.05)。
　　3.2腹膜結節(jié)VEGF-A，C，D蛋白表達:VEGF-A，C，D均在癌細胞胞漿著色，統(tǒng)計后發(fā)現(xiàn)VEGF-A在四

26、組表達有差別(p＜0.05)，兩兩比較，Group4＞Group2＞Group1(p＜0.05)，Group1與Group3無區(qū)別(p＞0.05)。而腹膜結節(jié)VEGF-C，VEGF-D的蛋白表達在四組間無明顯差別(p＞0.05)。
　　4、VEGF-A蛋白含量與腹水量高度相關，相關系數(shù)r=0.994(p＜0.01)。VEGF-A蛋白表達與腹膜結節(jié)數(shù)量高度相關，相關系數(shù)r=0.972(p＜0.01);與MVD及癌細胞光子數(shù)均無相關關

27、系(p＞0.05)。
　　結論:
　　1、本研究首次建立了穩(wěn)定整合luciferase的胃癌未分化NUGC-4-luc細胞系，并建立了以該細胞系為基礎的胃癌裸鼠腹水瘤模型，為利用生物發(fā)光活體成像技術，研究胃癌腹膜轉移瘤的生長轉移機制及抗癌藥物的研發(fā)，提供了穩(wěn)定可靠、直觀、方便、靈敏的動物模型。
　　2、本研究中恩度聯(lián)合順鉑及序貫組均耐受性好，治療應至少2周后差別顯著。首次結合活體成像及MVD，提示恩度聯(lián)合順鉑優(yōu)于序貫，

28、聯(lián)合組對癌細胞的殺傷及對血管內皮的抑制作用均最大;順鉑序貫恩度殺傷癌細胞優(yōu)于恩度序貫順鉑;恩度序貫順鉑對腹膜血管內皮的抑制優(yōu)于順鉑序貫恩度，故提示可以通過分子標志物預測靶點變化及功能成像監(jiān)測癌細胞數(shù)量，共同指導臨床合理選擇靶向及細胞毒藥物的用藥時機。
　　3、VEGF-A與腹水量及腹膜結節(jié)數(shù)量正相關，提示VEGF-A不僅可以預測腹水量還可以預測腹膜結節(jié)的變化，突破了臨床只依據(jù)腹水量判斷療效的局限性。VEGF-A與癌細胞光子數(shù)及MV