銀杏苦內(nèi)酯B對SAP大鼠胰腺組織p38MAPK和PTK活性的影響.pdf

1、目的：重癥急性胰腺炎(SAP)不僅僅是胰腺局部疾病，除了胰腺本身的水腫、出血、壞死，常出現(xiàn)全身性炎癥反應綜合癥(SIRS)并由此引起多器官功能衰竭(MOF)，這正是SAP高死亡率的主要原因。促炎性介質(zhì)水平升高及抗炎性介質(zhì)水平下降是SAP病情發(fā)展過程中導致SIRS及進一步發(fā)生MOF的關鍵。炎性介質(zhì)的基因表達為一系列信號轉導機制所調(diào)控，阻斷信號轉導通路的某一環(huán)節(jié)，抑制促炎性介質(zhì)的產(chǎn)生，有助于減少MOF的發(fā)生，減輕SAP的嚴重程度，降低死亡率

2、。銀杏苦內(nèi)酯B(Ginkgolide B)是從銀杏葉中提取的少量萜內(nèi)酯的一種。它是血小板活化因子(PAF)的特異性拈抗劑，可以競爭性的與PAF受體(PAF receptor PAFR)結合。PAF是參與SAP病情發(fā)生發(fā)展的重要促炎性介質(zhì)，其主要生物學效應有促進血小板聚集，促進白細胞趨化、脫顆粒和氧自由基形成，介導其它炎性介質(zhì)和細胞因子的合成與釋放等。PAF的生物學效應是通過與細胞膜上的特異性PAFR結合，激活細胞內(nèi)多條信號轉導途徑，包括

3、磷脂酰肌醇信號通路，絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路中的細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)、p38MAPK和c-Jun氨基末端激酶(JNK)通路，最終得以實現(xiàn)的。其中p38MAPK信號通路的主要功能是在轉錄后水平調(diào)控促炎細胞因子的基因表達，參與炎癥反應過程。已有課題來源：國家自然科學基金，編號 30300465大量體內(nèi)外實驗證明，胰腺炎時p38MAPK活性明顯升高，同時伴隨多種細胞因子基因表達的上調(diào)和血清水平的增高；應用p38MAPK抑

4、制劑進行干預能明顯降低血淀粉酶水平，減少白細胞浸潤，抑制細胞因子產(chǎn)生，減輕胰腺組織損傷，并且能夠提高實驗動物的生存率。PAFR屬于G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)家族，GPCR信號通路與蛋白酪氨酸激酶(PTK)信號通路間存在交叉對話作用，所以PTK可能在PAF信號轉導過程中發(fā)揮作用，但目前尚無相關報道。銀杏苦內(nèi)酯B作為PAF的特異性拮抗劑，用于實驗性SAP的治療已取得良好療效，但其作用機制尚不明確，對此還缺乏系統(tǒng)的研究。本研究我們用Weste

5、m blot和ELISA法檢測銀杏苦內(nèi)酯B對SAP大鼠胰腺組織p38MAPK和PTK活性的影響，從信號轉導通路水平探討銀杏苦內(nèi)酯B治療SAP的分子機制，為國藥開發(fā)和臨床應用提供理論依據(jù)。 方法：選用體重220g～250g的健康雄性Wistar大鼠180只，隨機分為SAP模型組(SAP)、銀杏苦內(nèi)酯B治療組(BN)和陰性對照組(NC)，每組又分為lh、2h、3h、6h、12h和24h組，共18組。通過向膽胰管內(nèi)逆行注射5％?；悄懰?/p>

6、鈉(1mL·kg<'-1>)，制備成SAP模型，NC組開腹后僅翻動十二指腸并觸摸胰腺數(shù)次。術后BN組股靜脈注射銀杏苦內(nèi)酯B(5mg·kg<'-1>)，NC組和SAP組股靜脈注射等量生理鹽水。分別在注射5％牛磺膽酸鈉后1h、2h、3h、6h、12h和24h處死大鼠，迅速取血及胰腺組織。一部分胰腺組織以中性緩沖甲醛固定，石蠟包埋切片后HE染色制片，觀察胰腺組織的病理學改變；另一部分以預冷的生理鹽水沖洗后切割成小塊，于液氮中速凍過夜，然后轉移

7、至-80℃超低溫冰箱妥善保存。采用全自動生化分析儀檢測血漿淀粉酶。用Westem blot法檢測p38MAPK的表達，用Bio-Rad圖像處理系統(tǒng)采集X線膠片的條帶，用QuamityOne圖像分析軟件進行條帶灰度測定。用ELISA檢測PTK活性。所有數(shù)據(jù)用均數(shù)土標準差(x±s)表示，組間差異比較用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。全部統(tǒng)計分析采用SPSS 11.5軟件完成。 結果：(1)膽胰管內(nèi)逆行注射5％?；悄懰徕c后

8、，各時間點均可見胰腺組織充血、水腫、出血、壞死和血性腹水，并隨時間延長胰腺組織病變程度加重、腹水量增多。大鼠SAP模型制備成功。BN組的表現(xiàn)較SAP組輕。NC組基本正常。(2)在各時間點，SAP組和BN組血漿淀粉酶水平均明顯高于NC組(P

9、在制模后即迅速增加，3h達高峰，6h及12h仍維持較高水平，在24h p38MAPK磷酸化水平仍高于NC組(P<0.05)。BN組磷酸化p38MAPK表達的變化在時相上與SAP模型組相當，但在6h、12h和24h各時間點，均較SAP組為弱(P<0.05)。在各時間點，SAP組和BN組磷酸化p38MAPK的表達均較NC組高(P<0.05)。(4)PTK活性于制模后1h即明顯升高，至24h仍維持在較高水平。在各時間點，SAP組和BN組胰腺組

10、織中PTK活性均較NC組為高(P<0.05)，但SAP組及BN組間沒有差別。 結論：(1)用膽胰管逆行注射5％?；悄懰徕c制備成的Wistar大鼠SAP模型，方法簡便、重復性好、成功率高，是一種較理想的SAP動物模型制備方法。(2)銀杏苦內(nèi)酯B能夠減輕胰腺組織損傷，有效降低血漿淀粉酶水平，對SAP發(fā)揮一定的治療作用。 (3)SAP組和BN組胰腺組織中p38MAPK和PTK活性均增高，表明p38MAPK和PTK均有可能參與了SAP