慢病毒載體(miRNA Sponge)介導(dǎo)miR-17、miR-20a基因沉默的抗白血病作用機(jī)制研究.pdf

1、目的：構(gòu)建miR-20a基因的miRNA Sponge載體，建立Jurkat-S穩(wěn)定細(xì)胞株，為進(jìn)一步研究miR-20a功能及應(yīng)用干擾技術(shù)治療奠定基礎(chǔ)；檢測急性白血病患者中miR-17、miR-20a前體的表達(dá)情況并探討miRNA Sponge介導(dǎo)的miR-17、miR-20a沉默的抗白血病作用機(jī)制。
　　方法：設(shè)計(jì)、合成一對含有2個(gè)重復(fù)針對miR-20a成熟序列第9-12堿基錯配的序列，并帶有酶切位點(diǎn)，退火后連接到pCDNA3.0

2、-L表達(dá)載體上；載體雙酶切后再與退火產(chǎn)物連接，重復(fù)4次，酶切及熒光素酶活性鑒定；亞克隆到慢病毒表達(dá)載體，與psPAX2、PMD2G共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，包裝產(chǎn)生慢病毒顆粒并測定病毒滴度，感染高表達(dá)miR-17、miR-20a的Jurkat細(xì)胞株；應(yīng)用real-time PCR和Western blot技術(shù)分別檢測Jurkat-S穩(wěn)定細(xì)胞中P21及E2F1 mRNA和蛋白水平的表達(dá)，并與對照組進(jìn)行比較；CCK-8方法及流式細(xì)胞儀方法分

3、別檢測miR-17、miR-20a沉默對Jurkat細(xì)胞增殖能力及細(xì)胞周期的影響。采用real-time PCR方法檢測初治急性白血病患者及白血病細(xì)胞株中miR-17、miR-20a前體的表達(dá)水平，分析其在各型白血病中的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:成功構(gòu)建針對miR-20a基因的Sponge載體，病毒滴度為5×107TU/ml；建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的Jurkat-S細(xì)胞株，有效干擾驗(yàn)證顯示miR-20a Sponge能明顯上調(diào)P21及E2F1的

4、mRNA及蛋白水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)；初治急性白血病患者中miR-17、miR-20a前體的表達(dá)明顯高于正常對照(p<0.05)；且與急性髓系白血病患者相比，急性淋巴細(xì)胞白血病患者中的表達(dá)量更高；然而二者表達(dá)量與患者外周血白細(xì)胞水平無明顯相關(guān)性(p>0.05)；miR-17、miR-20a沉默能抑制Jurkat細(xì)胞的增殖，且導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯于G1-S期。
　　結(jié)論：成功構(gòu)建miR-20a基因的miRNA Spong