BM-MSC誘導(dǎo)移植免疫耐受和修復(fù)慢性移植腎損傷的初步研究.pdf

1、本文從以下三部分進行了論述。
　　第一部分骨髓間充質(zhì)干細胞的分離、純化、鑒定及體內(nèi)分布與輸注途徑的關(guān)系。
　　目的:探討骨髓間充質(zhì)干細胞(BM-MSC)分離、純化和細胞鑒定的方法和超順磁氧化鐵(SPIO)標(biāo)記BM-MSC方法的安全性及可行性，分析BM-MSC在體內(nèi)分布與細胞輸注途徑的關(guān)系，以確定BM-MSC的最佳輸注途徑。
　　方法:取西藏小型豬骨髓，采用密度梯度離心法對骨髓間充質(zhì)干細胞進行分離和純化，觀察其生長曲線。

2、對所獲取的細胞進行成脂、成骨誘導(dǎo)分化，并應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測細胞表面標(biāo)志物CD45/CD90/CD105，以鑒定所純化細胞是否為BM-MSC。應(yīng)用SPIO對BM-MSC進行體外標(biāo)記，用MTT法檢測不同濃度SPIO對標(biāo)記后細胞活力和增殖能力的影響。建立西藏小型豬同種異體腎移植模型，分別經(jīng)移植腎動脈和經(jīng)髂總靜脈輸注SPIO標(biāo)記的BM-MSC，切取受體豬各器官，通過普魯士藍染色和透射電鏡觀察標(biāo)記的BM-MSC在移植腎、肺臟及其他器官的分布情況。

3、
　　結(jié)果:應(yīng)用梯度密度離心法可獲取高純度的BM-MSC，細胞具有良好的生長活力和傳代能力。BM-MSC可經(jīng)誘導(dǎo)向成骨細胞和脂肪細胞分化，應(yīng)用茜紅素和油紅O染色可檢測出細胞中鈣結(jié)節(jié)和脂肪顆粒;經(jīng)流式細胞術(shù)檢測細胞表面標(biāo)志物CD90陽性率為96.9％，CD105陽性率為95.7％，CD45陽性率為1.1％（陰性）。SPIO對BM-MSC的標(biāo)記率接近100％，通過MTT法檢測25ug/ml的SPIO對BM-MSC的增殖能力影響較少、又

4、可有效標(biāo)記細胞是比較適宜的標(biāo)記濃度，50ug/ml的SPIO標(biāo)記細胞2天后細胞活性減退。透射電鏡可觀察到BM-MSC細胞內(nèi)小囊泡包含的高密度鐵粒子。采用供腎動脈與髂總動脈、供腎靜脈與髂總靜脈端側(cè)吻合的方式成功建立西藏小型豬腎移植模型，將標(biāo)記的BM-MSC分別經(jīng)移植腎動脈和髂總靜脈輸注后，觀察BM-MSC在受體豬體內(nèi)分布顯示:經(jīng)移植腎動脈輸注組，BM-MSC在移植腎內(nèi)定植的細胞數(shù)明顯多于經(jīng)髂總靜脈輸注組，且存在統(tǒng)計學(xué)差異;經(jīng)髂總靜脈輸注組

5、，肺內(nèi)的細胞數(shù)增加，有統(tǒng)計學(xué)差異。兩種輸注途徑均未發(fā)生血管栓塞、感染等并發(fā)癥。
　　結(jié)論:采用密度梯度離心法可獲取高純度、生長活力良好的BM-MSC;利用細胞外形特征、誘導(dǎo)定向分化和細胞表面標(biāo)志物可成功鑒定BM-MSC;應(yīng)用SPIO標(biāo)記BM-MSC的方法簡便可行，易于細胞在體內(nèi)示蹤;經(jīng)移植腎動脈輸注BM-MSC是安全和理想的輸注途徑，有利于BM-MSC在移植腎內(nèi)定植、分化。
　　第二部分自體BM-MSC誘導(dǎo)親屬活體供腎移植免

6、疫耐受的臨床初步研究。
　　目的:通過對親屬活體腎移植受者輸注自體間充質(zhì)干細胞聯(lián)合應(yīng)用低劑量FK506進行免疫誘導(dǎo)，觀察移植術(shù)后受者的移植腎功能、淋巴細胞亞群及比例和急性排斥反應(yīng)發(fā)生率等指標(biāo)，探討自體骨髓間充質(zhì)干細胞誘導(dǎo)移植免疫耐受的效果及其作用機制。
　　方法:隨機選擇2009.9-2012.9在我中心擬行親屬活體供腎移植的慢性腎功能不全（尿毒癥期）患者，按照納入標(biāo)準(zhǔn)入組，分為不輸注自體BM-MSC的對照組（10例）和輸注

7、自體BM-MSC的實驗組
　　（10例）。實驗組在術(shù)前1月行自體骨髓間充質(zhì)干細胞制備，分別在術(shù)中、術(shù)后1周和術(shù)后1月共3次輸注自體BM-MSC。首次在術(shù)中經(jīng)移植腎動脈輸注，細胞數(shù)5×106;術(shù)后1周和1月經(jīng)外周靜脈輸注，細胞數(shù)1×106/kg/次。對照組FK506初始劑量為0.08mg·kg-1·d-1，實驗組FK506初始劑量為0.04-0.05mg·kg-1·d-1，嗎替麥考酚和強的松用量兩組相同。術(shù)后動態(tài)觀察移植腎功能、24

8、小時尿蛋白、淋巴細胞計數(shù)和比例，應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測淋巴細胞亞群及比例，并行程序性移植腎穿刺活檢，以觀察急性排斥反應(yīng)的發(fā)生率等。
　　結(jié)果:采用梯度密度離心法可獲取高純度BM-MSC，其細胞表型為CD44+CD29+CD105+CD48+CD34+。20例受者手術(shù)成功，術(shù)后未發(fā)生移植腎動靜脈栓塞、DGF、感染、GVHD等并發(fā)癥。對照組中1例在移植術(shù)后7天發(fā)生急性血管性排斥反應(yīng)并移植腎破裂，實驗組未發(fā)生急性排斥反應(yīng)。實驗組與對照組均可

9、維持良好的移植腎功能（Cr和Ccr）;實驗組在術(shù)后早期（1周）24小時尿蛋白定量為308.1±55.1mg，低于對照組727.2±178.1mg，P＜0.05，有統(tǒng)計學(xué)差異;實驗組與對照組淋巴細胞計數(shù)和比例、NK細胞的比例、T淋巴細胞亞群CD3+CD4+、CD3+CD8+的計數(shù)和CD3+CD4+/CD3+CD8+比值、Treg細胞的比例在術(shù)后各時間觀察點（術(shù)后1周、1月、3月和6月）均無統(tǒng)計學(xué)差異，P＞0.05。
　　結(jié)論:自體骨

10、髓間充質(zhì)干細胞聯(lián)合低劑量FK506能獲得理想的移植腎功能，在早期可促進移植腎急性損傷的修復(fù);可獲得有效的免疫抑制效果，對淋巴細胞計數(shù)和比例、NK細胞的比例、T淋巴細胞亞群計數(shù)及比值達到有效調(diào)節(jié);可以上調(diào)Treg細胞的比例，在一定程度上誘導(dǎo)移植免疫耐受。
　　第三部分修復(fù)慢性移植腎損傷的臨床實驗研究。
　　目的:通過對慢性移植腎腎病(CAN)的患者輸注骨髓間充質(zhì)干細胞(BM-MSC)，觀察移植腎功能和移植腎間質(zhì)纖維化等指標(biāo)的變

11、化，探討B(tài)M-MSC對慢性移植腎腎病患者移植腎功能的影響和修復(fù)慢性移植腎損傷的機制。
　　方法:選擇2009.12-2012.6確診為慢性移植腎腎病且符合納入標(biāo)準(zhǔn)的的患者10例，制備第三方健康骨髓間充質(zhì)干細胞，予CAN患者共三次輸注BM-MSC，輸注時間為0天、7天和1月。首次在DSA引導(dǎo)下經(jīng)移植腎動脈輸注，細胞數(shù)1.0×106/kg;第2、3次經(jīng)外周靜脈輸注，細胞量為5.0×106/kg。臨床觀察指標(biāo)包括:Cr、BUN、Ccr、

12、24小時尿蛋白、血/尿β2微球蛋白。在治療前和治療后6月行移植腎活檢，應(yīng)用JD圖像分析系統(tǒng)檢測腎間質(zhì)纖維化指標(biāo)(LN、FN、TGF-β、CTGF)的變化。
　　結(jié)果:除1例患者在第2次輸注BM-MSC時出現(xiàn)過敏反應(yīng)外，未發(fā)生出血、移植腎動脈栓塞、假性動脈瘤和感染等與BM-MSC輸注相關(guān)的并發(fā)癥。移植腎功能Cr和BUN在治療前為203.7±46.4umol/L、15.43±8.46mmol/L，治療后1周、1月分別為185.5±46

13、.2umol/L,12.15±4.96mmol/L和172.6umol/L、11.76±5.12mmol/L，與治療前比較有下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.05;而3月及以后的移植腎功能Cr、BUN與治療前比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。Ccr在治療后7天、1月、3月分別為43.18±18.04ml/min，43.18±18.04ml/min，48.04±22.34ml/min，較治療前38.01±12.96 ml/min增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義

14、，P＜0.05。治療后1月24小時尿蛋白定量為478.5±289.3mg，較治療前（105.6±327.3mg）減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.05;治療后3月及以后則無統(tǒng)計學(xué)差異。腎間質(zhì)纖維化指標(biāo)FN、LN在治療6月后的平均光密度值為（0.174±0.027，0.199±0.015）與治療前（0.182±0.019，0.212±0.013）相比有下降，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，P＞0.05; TGF-β和CTGF在治療6月后的平均光密度值為