Claudin-3作為候選癌標(biāo)在前列腺癌診治中的應(yīng)用研究.pdf

1、前列腺癌為中老年男性常見的惡性腫瘤和主要死亡原因之一。在美國男性的癌癥相關(guān)致死原因中前列腺癌占據(jù)了第二的位置。在惡性腫瘤中，前列腺癌的自然病史較為獨特，它發(fā)病隱匿，早期缺乏特征性表現(xiàn)，易發(fā)生早期轉(zhuǎn)移，出現(xiàn)癥狀后，往往已是晚期。另一方面，目前前列腺癌多采用手術(shù)治療，創(chuàng)傷較大，雖然可以應(yīng)用內(nèi)分泌療法進(jìn)行治療，但治療是姑息性的，腫瘤最終將失去對內(nèi)分泌治療的敏感性而繼續(xù)發(fā)展，導(dǎo)致患者死亡；而且前列腺腫瘤對化療敏感性差，治療較為棘手。上皮來源的腫

2、瘤占了全部惡性腫瘤的90％，他們對化療藥物的不敏感成為臨床上遇到的主要問題之一。在前列腺癌診斷和治療領(lǐng)域，尋找和鑒定前列腺癌差異表達(dá)基因，將其作為前列腺癌診斷及治療靶點目前已經(jīng)成為國際上研究前列腺癌的熱點之一。 研究表明在腫瘤發(fā)生過程中，細(xì)胞間的緊密連接、連接粘附分子和基底蛋白等膜蛋白存在異常表達(dá)。這些研究提示異常表達(dá)的膜蛋白對于作用于腫瘤細(xì)胞的藥物來說可能具有重要意義。 Claudin蛋白是存在于緊密連接中的分子量約

3、為23KDa的跨膜蛋白，它在緊密連接的屏障功能當(dāng)中起了非常重要的作用。包括Claudin-3和Claudin-4在內(nèi)，Claudin蛋白家族有超過20個成員，并且它們表現(xiàn)出明顯的組織特異性。有趣的是，在卵巢癌、肝細(xì)胞癌、胰腺癌、前列腺癌等上皮來源的惡性腫瘤中，常常觀察到Claudin蛋白有上調(diào)表達(dá)。而且研究發(fā)現(xiàn)Claudin-3有可能作為前列腺癌的上調(diào)表達(dá)基因，成為前列腺癌新的候選癌標(biāo)進(jìn)行臨床診治的研究。 隨著化學(xué)、藥理學(xué)、蛋白

4、質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)等研究領(lǐng)域的快速發(fā)展，目前發(fā)現(xiàn)并研制了很多新的抗腫瘤藥物，但就臨床應(yīng)用來說，有必要找到一種使這些新藥更有選擇性發(fā)揮其作用的藥物傳輸系統(tǒng)。產(chǎn)氣莢膜梭菌腸毒素(CPE)可能成為這一系統(tǒng)，它是一個分子量為35KDa的多肽，能導(dǎo)致食物中毒并與大多數(shù)的人食源性傳染病相關(guān)。該腸毒素有兩個功能不同的區(qū)域組成：一個是N-末端大約為22KDa的區(qū)域，主要起細(xì)胞毒作用；另一個是C-末端大約為13KDa的區(qū)域，這一結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)了CPE和目標(biāo)細(xì)胞

5、膜的結(jié)合并使之部分的進(jìn)入胞質(zhì)內(nèi)部，引發(fā)細(xì)胞對大量小分子通透性的改變，從而引起細(xì)胞的空泡變和溶解。在Claudin蛋白家族中只有Claudin-3和4是CPE的受體，可以結(jié)合CPE并引起胞溶作用。這些發(fā)現(xiàn)表明CPE可以用來特異性結(jié)合上皮來源癌細(xì)胞中的Claudin跨膜蛋白。目前CPE已經(jīng)被成功的用于治療高表達(dá)Claudin-3和4的卵巢癌和胰腺癌中。本研究擬通過實驗探討Claudin-3作為CPE的靶標(biāo)在前列腺癌診治中可否成為一個候選癌標(biāo)

6、。 方法：采用免疫組化及Western blot方法檢測Claudin-3在前列腺增生及前列腺腫瘤組織的表達(dá)狀態(tài)，同時分析Claudin-3與前列腺癌病理分期的關(guān)系，評價Claudin-3作為前列腺癌診斷候選癌標(biāo)的價值。培養(yǎng)并鑒定表達(dá)腸毒素的產(chǎn)氣莢膜梭菌標(biāo)準(zhǔn)菌株64615，接著提取細(xì)菌的基因組DNA，PCR擴(kuò)增克隆出全長cpe基因并連接入pET-28a載體質(zhì)粒中，構(gòu)建含全長cpe基因的重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-cpe，經(jīng)酶切及

7、測序鑒定正確后，轉(zhuǎn)化入感受態(tài)E.coli BL21中表達(dá)，并優(yōu)化表達(dá)條件，進(jìn)行最適誘導(dǎo)劑濃度和最適誘導(dǎo)時間的篩選；再通過Ni-NTA柱進(jìn)行親和層析純化。純化后的CPE作用于體外培養(yǎng)的人前列腺癌細(xì)胞株22RV1以及前列腺癌荷瘤裸小鼠模型，在CPE安全劑量下觀察CPE激發(fā)的對前列腺癌癌細(xì)胞的抑制作用，進(jìn)一步探討Claudin-3作為前列腺癌治療候選靶點的可行性及安全性，為CPE今后的臨床應(yīng)用打下基礎(chǔ)。 結(jié)果： 1、前列腺組織

8、石蠟切片免疫組化半定量分析顯示Claudin-3在前列腺組織腺體周圍細(xì)胞的胞膜中均有不同程度的表達(dá)；前列腺癌組中的表達(dá)顯著高于良性前列腺增生組，但在前列腺癌的高、中、低分化組中表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異。用Western blot方法對前列腺組織中Claudin-3蛋白的含量分析顯示：前列腺癌組中的Claudin-3蛋白表達(dá)顯著高于前列腺增生組。 2、復(fù)蘇、培養(yǎng)產(chǎn)腸毒素的產(chǎn)氣莢膜梭菌標(biāo)準(zhǔn)菌株64615，并進(jìn)行菌株的鑒定。提取細(xì)菌的基因組D

9、NA，PCR擴(kuò)增出全長cpe基因，并與質(zhì)粒載體pET-28a連接，構(gòu)建了重組的pET-28a-cpe質(zhì)粒，酶切鑒定及測序結(jié)果表明，成功構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-cpe。 3、將質(zhì)粒pET-28a-cpe轉(zhuǎn)化入E.coli BL21感受態(tài)中誘導(dǎo)表達(dá)，并優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)的條件，最后通過Ni-NTA親和層析進(jìn)行分離純化，純化后的重組CPE蛋白濃度達(dá)到90％以上。 4、進(jìn)行人前列腺癌細(xì)胞株22RV1和PC-3的體外培養(yǎng)，并應(yīng)

10、用Claudin-3單抗進(jìn)行免疫熒光染色，證實體外培養(yǎng)的人前列腺癌細(xì)胞株22RV1可以特異性高表達(dá)Claudin-3。將CPE作用于培養(yǎng)的22RV1，顯示CPE對腫瘤細(xì)胞具有明顯的細(xì)胞毒作用，細(xì)胞增殖明顯降低。 5、建立種植22RV1的前列腺癌荷瘤裸鼠模型。將CPE進(jìn)行瘤內(nèi)注射，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞壞死、腫瘤體積明顯縮小，腫瘤生長明顯延緩。 結(jié)論：Claudin-3在前列腺癌組織中有特異性高表達(dá)，但與腫瘤的惡性程度相關(guān)性不明顯；

11、運用基因工程方法，成功構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-cpe并轉(zhuǎn)化E.coli BL21，誘導(dǎo)其表達(dá)CPE后，通過Ni-NTA親和層析進(jìn)行分離純化，獲得了較高純度的CPE；CPE對特異性高表達(dá)Claudin-3的體外培養(yǎng)前列腺癌細(xì)胞株及前列腺癌荷瘤裸鼠模型均能產(chǎn)生明顯生物學(xué)效應(yīng)，發(fā)生細(xì)胞毒性作用，使腫瘤細(xì)胞壞死、腫瘤生長延緩。上述結(jié)果提示Claudin-3可能成為前列腺癌診斷和治療的新癌標(biāo)；本研究為CPE應(yīng)用于腫瘤的臨床研究及治療提供