納米金標芯片優(yōu)化及在前列腺癌臨床診斷上的應用研究.pdf

1、近年來，我國男性前列腺癌發(fā)病率呈明顯上升趨勢，在歐美國家，前列腺癌己連續(xù)多年居男性惡性腫瘤發(fā)病率首位，其發(fā)病率超過肺癌，死亡率在男性惡性腫瘤中居第二位。前列腺癌是一個起源于多病灶和隨機進展模式的異質性疾病。到目前為止對晚期和轉移性尤其是激素非依賴型、放療和化療抵抗型前列腺癌依然沒有治愈的療法。研究前列腺癌進展相關的基因可能揭示其機制或找出新的治療靶標。
　　 基因芯片技術具有高通量、高特異性等特點，在疾病診斷等領域應用前景廣泛，

2、但是目前主要基因芯片技術均存在著檢測儀器昂貴或靈敏度較低等問題，從而限制該技術的進一步發(fā)展。
　　 本研究利用納米金可以與銀結合后形成體積為原來106倍的黑色顆粒，并且可以憑肉眼觀察，普通掃描儀讀取圖像的特點，將納米金應用于基因芯片檢測技術。首先建立定性檢測的納米金標記芯片技術，并對芯片技術中點樣液，預雜交，納米金濃度，銀染時間等多個條件進行了優(yōu)化，結果表明，使用50％DMSO作為點樣液效果最好，預雜交會導致雜交信號降低70％，

3、銀染時間控制在15 min時顯色清晰且背景較低。該檢測方法的靈敏度可達到80 fmol/L，為建立穩(wěn)定性，重復性好的納米金標芯片技術打下基礎。
　　 同時摸索將納米金標芯片技術用于前列腺癌臨床診斷，PCa是多因素、多基因突變引起的疾病，憑單一指標的檢測無法準確判斷，故經充分的文獻調研，預選了11個前列腺癌特異性靶標(IGF1、P27、AR、PSMA、KLK3/PSA、PCNA、Ki-67、KLK1、KLK2、TMPRSS2、SR

4、EBF2)進行檢測，對各基因表達進行研究。本研究首次將納米金標芯片用于基因表達研究，為更好的達到實驗目的，首先使用目前已經成熟并且成本較低的辣根過氧化物酶標記法摸索建立了探針設計，芯片制備，樣本標記，至雜交反應的前期實驗條件。研究發(fā)現(xiàn)：
　　 (1)寡核苷酸探針濃度達到100μM時，各檢測點信號最強。
　　 (2)進行樣本標記過程中，采用biotin-16-dUTP為40μM，而dTTP為40μM的反轉錄體系。
　

5、　 (3)使用辣根過氧化物酶芯片標記法對PC3和DU145兩種細胞株的11個前列腺癌特異靶標進行檢測，發(fā)現(xiàn)兩種標本中各基因表達差異不明顯，這為使用納米金標芯片檢測提供了一個依據(jù)。
　　 在前期研究基礎之上，雜交后改用納米金進行標記，并對納米金濃度進行了優(yōu)化，在稀釋梯度為1∶100(此時納米金濃度為0.250D/ml)時，研究結果為各探針點呈現(xiàn)明顯的顯色點，陰性對照無顯色，符合實驗要求，但是在定量方面暫時還不滿足實驗要求。