EV71感染宿主中樞神經(jīng)系統(tǒng)過程中宿主因子作用的初步探究.pdf

1、手足口病(Hand，foot and mouth disease，HFMD)近些年來在中國大范圍流行，導(dǎo)致大量嬰幼兒患者死亡。腸道病毒71型(enterovirus71，EV71)被認定為手足口病重癥和致死病例中最主要的病原體。EV71是小RNA病毒家族的成員之一，和其他小RNA病毒相似，EV71的基因組為一條長約7.4 kb的單股正鏈RNA，其中只有一個開放閱讀框（open reading flame，ORF），在其ORF兩端分別有5

2、'和3'非編碼區(qū)(untranslated regions，UTR)。在5'UTR區(qū)形成了高度保守的二級結(jié)構(gòu):三葉草狀(clover leaf like)莖環(huán)結(jié)構(gòu)(stem loopⅠ)和一個內(nèi)部核糖體進入位點(Internal ribosome site，IRES)。根據(jù)現(xiàn)有的對其他小RNA病毒的研究結(jié)果提示，5'UTR區(qū)的這兩個結(jié)構(gòu)與病毒的復(fù)制和翻譯有著密切的關(guān)系。一些宿主蛋白可以與病毒5' UTR的三葉草莖環(huán)結(jié)構(gòu)結(jié)合，調(diào)控病毒的R

3、NA復(fù)制過程;而IRES結(jié)構(gòu)可以在一些宿主蛋白以及IRES反式作用因子（IRES trans-acting factors，ITAFs）的共同作用下，以5'帽非依賴的方式起始病毒蛋白的翻譯過程。同時，病毒基因組的3' UTR區(qū)被認為與病毒基因組的穩(wěn)定和復(fù)制相關(guān)。
　　 EV71是嗜神經(jīng)性腸道病毒，它可以感染宿主神經(jīng)系統(tǒng)，引起無菌性腦脊髓膜炎、脊髓灰質(zhì)炎樣麻痹、腦干腦炎等并發(fā)癥，重癥病例具有較高的死亡率。EV71病毒感染神經(jīng)細胞的

4、分子機制是本實驗室的研究重點。神經(jīng)細胞中哪些宿主蛋白參與了病毒復(fù)制和翻譯的調(diào)控過程——這是本文要解決的主要科學問題。
　　 在本文中我們首先構(gòu)建及改造EV71全長cDNA感染性克隆。我們利用高保真RT-PCR技術(shù)成功將EV71全長cDNA基因組裝入pBR322載體，構(gòu)建了EV71全長cDNA克隆。將該克隆體外轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)染對EV71敏感的RD細胞株，通過觀察細胞病變效應(yīng)(cytopathic effect，CPE)，用RT-PCR檢

5、測EV71負鏈基因組以及空斑法鑒定，驗證了該克隆具備感染性。隨后用空斑法建立了該感染性克隆拯救病毒的一步生長曲線（one-step growth curve）。隨后我們運用定點突變技術(shù)在EV715'UTR中的IRES結(jié)構(gòu)兩端分別引入了兩個單一的限制性內(nèi)切酶識別位點(NsiI，XbaI)，并驗證了該突變株感染性克隆的感染性，為后續(xù)的替換或改造EV71 IRES結(jié)構(gòu)以研究病毒的神經(jīng)嗜性實驗奠定了基礎(chǔ)。與此同時，我們篩選了與5' UTR、3'

6、UTR相互作用從而影響EV71翻譯或復(fù)制過程的宿主因子，特別是在EV71引起嚴重病變的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中影響該過程的宿主因子。我們將EV715'UTR及其分段的莖環(huán)結(jié)構(gòu)、3'UTR制備為生物素標記的RNA探針，利用Biotin-pull down技術(shù)聯(lián)合質(zhì)譜分析，篩選出了兩個可以和EV715'UTR特異結(jié)合的宿主蛋白PCBP2和PTBP1。隨后我們使用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灱癢estern blot驗證了PCBP2在翻譯水平上對EV71 I