RA患者血清免疫復(fù)合物對HUVEC生物活性的影響及其瓜氨酸化抗原的鑒定分析.pdf

1、研究目的:
　　類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一種常見的自身免疫性疾病，其發(fā)病機(jī)制目前并不完全清楚。已發(fā)現(xiàn)在RA患者血清、關(guān)節(jié)滑膜液和軟骨組織表層存在大量免疫復(fù)合物(immune complex，IC)，IC中含有大量瓜氨酸化蛋白質(zhì)，如瓜氨酸化纖維蛋白原和瓜氨酸化波形蛋白等。IC可激活補(bǔ)體系統(tǒng)并促進(jìn)細(xì)胞因子等炎性介質(zhì)的釋放，引起關(guān)節(jié)骨和軟骨組織發(fā)生損傷，進(jìn)而引起不可逆的關(guān)節(jié)畸變等功能損害。在RA發(fā)展過程中，一個(gè)重要的病理改變就是滑膜血管翳

2、(pannus)的形成。RA的發(fā)生發(fā)展與血管翳密切相關(guān)，且血管翳形成的因素十分復(fù)雜，這可能是導(dǎo)致RA病程遷延，治療困難的主要原因。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，RA患者尤其是血清抗瓜氨酸化蛋白抗體(ACPA)陽性(ACPA+)患者血清ACPA特異性IC(ACPA-IC)水平顯著升高，ACPA-IC在RA患者血清中出現(xiàn)可能具有重要的致病意義。本文擬在前期研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究RA患者血清IC(RA-IC)對人血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響，并用蛋白質(zhì)組學(xué)

3、技術(shù)對RA-IC中的瓜氨酸化抗原成分進(jìn)行鑒定。
　　研究方法:
　　1.標(biāo)本來源本實(shí)驗(yàn)中血清標(biāo)本取自南京軍區(qū)南京總醫(yī)院門診及住院患者，RA患者10例，均為血清ACPA陽性;SLE患者10例和體檢健康者對照10例均為血清ACPA陰性。RA診斷均符合美國風(fēng)濕病學(xué)學(xué)會(huì)(ACR)和歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟(EULAR)2010年修訂的RA分類標(biāo)準(zhǔn)[8];SLE診斷均符合SLE國際臨床協(xié)作組(SLICC)2009年修訂的SLE分類標(biāo)準(zhǔn)[8]。

4、標(biāo)本收集均獲得患者及主管醫(yī)師知情同意。
　　2.IC提取及鑒定。用G蛋白免疫親和層析法分別從RA患者、SLE患者及正常對照血清中提取IC?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析法、western blot方法分別對RA患者IC（RA-IC）中ACPA和瓜氨酸化抗原進(jìn)行初步鑒定。
　　3.RA-IC對人血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)生物學(xué)功能的影響。取對數(shù)生長期HUVEC細(xì)胞，分別用RA患者血清IC(RA-IC)、SLE患者血清IC(SLE-IC)、健

5、康人血清IC(C-IC)刺激HUVEC，培養(yǎng)24h后，用CCK-8細(xì)胞增殖法檢測其增殖水平，Transwell小室法檢測細(xì)胞遷移情況。
　　4.用兔抗瓜氨酸化抗體免疫共沉淀法純化RA-IC中瓜氨酸化免疫復(fù)合物，Thermo-fisher LTQ-Orbitrap高精度液質(zhì)聯(lián)用型質(zhì)譜技術(shù)鑒定RA-IC中的抗原成分。
　　研究結(jié)果:
　　1.用G蛋白柱免疫親和層析法從RA及對照組血清中純化出純度較高的抗原抗體IC;west

6、ern blot法鑒定發(fā)現(xiàn)，與對照組IC(SLE-IC、C-IC)相比，RA-IC中含有與兔抗瓜氨酸抗體相結(jié)合的抗原成分。
　　2.與SLE-IC、C-IC相比，RA-IC在一定濃度下，能顯著促進(jìn)HUVEC增殖和遷移。
　　3.RA-IC經(jīng)兔抗瓜氨酸化抗體免疫共沉淀后，用Thermo-fisher LTQ-Orbitrap高精度液質(zhì)聯(lián)用型質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行抗原成分鑒定，發(fā)現(xiàn)在RA-IC中5種特異性抗原。
　　結(jié)論: