基于合理設(shè)計(jì)的聚合物納米給藥系統(tǒng)用于提高蛋白質(zhì)多肽藥物和siRNA體內(nèi)外功效.pdf

1、基于納米載體的藥物遞送系統(tǒng)可提高藥物穩(wěn)定性、控釋藥物、促進(jìn)藥物體內(nèi)吸收、改善治療功效和降低毒副作用。為了充分發(fā)揮納米載體的上述作用特點(diǎn)，必須全面系統(tǒng)研究其體內(nèi)外作用機(jī)制，為合理設(shè)計(jì)納米給藥載體提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。蛋白質(zhì)多肽藥物和基因等生物大分子因水溶性好、分子量大、體內(nèi)生理環(huán)境影響其活性和穩(wěn)定性等，透膜吸收較差，需借助載體遞送方可更好發(fā)揮其功效。尤其是口服給藥不借助載體遞送根本無法有效使用，其中納米載體是其主要的遞送系統(tǒng)。納米載體的理化

2、性質(zhì)如粒徑、表面電荷等影響其細(xì)胞攝取、口服吸收和體內(nèi)生物分布，研究其影響規(guī)律和機(jī)制，據(jù)此合理設(shè)計(jì)高效納米遞送系統(tǒng)。
　　本文以殼聚糖衍生物聚合物納米粒為模型，研究其粒徑、表面電荷等理化性質(zhì)對(duì)蛋白質(zhì)多肽藥物體內(nèi)外吸收、分布的影響規(guī)律及機(jī)制。設(shè)計(jì)同時(shí)具有主動(dòng)靶向作用、促進(jìn)藥物口服吸收和細(xì)胞攝取，并可有效克服小分子干擾RNA(smallinterfering RNA，siRNA)藥物體內(nèi)外遞送屏障、介導(dǎo)高效體外基因沉默和口服后體內(nèi)RNA

3、干擾（RNA interference，RNAi）功效的新型多功能殼聚糖衍生物-甘露糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽(MTC)納米粒，研究其作為腫瘤壞死因子-α(TNF-α) siRNA口服給藥遞送載體的載藥與釋藥、體內(nèi)外作用機(jī)制、口服給藥對(duì)脂多糖(LPS)/D-半乳糖胺(D-GalN)誘導(dǎo)小鼠或大鼠急性肝損傷及葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的治療功效。
　　1聚合物納米粒粒徑與表面電荷對(duì)細(xì)胞攝取和生物分布的影響
　　研

4、究載蛋白質(zhì)多肽藥物聚合物納米粒粒徑、表面電荷對(duì)納米粒細(xì)胞攝取及動(dòng)物體內(nèi)生物分布的影響和機(jī)制?？煽刂苽淞綖?50、500、1500 nm和Zeta電勢為-15、-25、-40 mV的羅丹明B熒光標(biāo)記羧甲基殼聚糖納米粒RhB-CMCNP，包載FITC熒光標(biāo)記的蛋白質(zhì)多肽模型藥物硫酸魚精蛋白(HTC-PS)，制得雙熒光標(biāo)記的載藥聚合物納米粒RhB-CMCNP-PS，研究表明血漿及(I)-環(huán)境中熒光穩(wěn)定。研究了RhB-CMCNP-PS的細(xì)胞攝

5、取，結(jié)果表明:荷較強(qiáng)負(fù)電且粒徑較大的RhB-CMCNP-PS更易被小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬;荷較弱負(fù)電且粒徑較小的RhB-CMCNP-PS更易被非巨噬細(xì)胞攝取，且納米粒攝取行為呈細(xì)胞株依賴性;納米粒在非巨噬細(xì)胞主要通過代謝能量依賴的、肌動(dòng)蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞入胞。H-22荷瘤昆明小鼠尾靜脈注射RhB-CMCNP-PS后，荷較弱負(fù)電且粒徑較小的納米粒及所載藥物更易在腫瘤部位蓄積。
　　2聚合物納米粒粒徑對(duì)蛋白質(zhì)藥物口服吸收的影響
　　研

6、究載蛋白質(zhì)多肽藥物聚合物納米粒粒徑對(duì)藥物釋放、細(xì)胞攝取、小腸轉(zhuǎn)運(yùn)、口服吸收和動(dòng)物體內(nèi)生物分布的影響及機(jī)制?？煽刂苽鋃eta電勢為-35 mV、粒徑分別為300、600、1000nm的羅丹明B熒光標(biāo)記羧化殼聚糖納米粒RhB-CCNP，包載FITC熒光標(biāo)記的蛋白質(zhì)多肽模型藥物牛血清白蛋白(FITC-BSA),制得雙熒光標(biāo)記的載藥聚合物納米粒RhB-CCNP-BSA，研究表明血漿及含有各種類型化學(xué)熒光淬滅劑的溶液中熒光穩(wěn)定。研究了粒徑對(duì)RhB

7、-CCNP-BSA的親水性、Caco-2細(xì)胞攝取量、大鼠小腸黏膜黏附性、體外Caco-2細(xì)胞單層模型轉(zhuǎn)運(yùn)和吸收量、大鼠離體小腸轉(zhuǎn)運(yùn)和在體小腸吸收量的影響，結(jié)果表明均隨粒徑減小而增加。研究了RhB-CCNP-BSA的大鼠小腸在體釋放，結(jié)果表明:粒徑較小的RhB-CCNP可釋放更多FITC-BSA至大鼠小腸黏膜而非腸腔中，避免FITC-BSA被腸腔內(nèi)消化酶降解失活。小腸派氏結(jié)處M細(xì)胞是載藥聚合物納米粒轉(zhuǎn)運(yùn)和吸收的重要部位。健康昆明小鼠口服給

8、藥后，RhB-CCNP-BSA在血液和主要臟器的分布比例隨粒徑減小而增大;H-22荷瘤昆明小鼠口服給藥后，粒徑較小的RhB-CCNP-BSA經(jīng)小腸轉(zhuǎn)運(yùn)吸收，可有效遞送至血液和主要組織中。
　　3基于MTC的siRNA口服高效納米給藥系統(tǒng)用于急性肝損傷的治療及機(jī)制
　　殼聚糖(Mw200 kDa、500 kDa)經(jīng)季銨化、甘露糖和巰基基團(tuán)修飾制得MTC聚合物-MTC200和MTC500，季銨化度均為30％，甘露糖修飾度分別為1

9、1％和15％，游離巰基含量分別為109.7±2.5和105.4±3.1μmol/g，二硫鍵含量分別為180.5±0.8和197.3±0.6μmol/g;與TPP離子交聯(lián)制備納米粒，包載TNF-αsiRNA，粒徑約150nm，Zeta電勢約30 mV;納米粒在生理環(huán)境結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，保護(hù)siRNA免受核酶降解。MTC納米粒可改善siRNA口服后的小腸轉(zhuǎn)運(yùn)和吸收，經(jīng)全身血液循環(huán)、淋巴循環(huán)和巨噬細(xì)胞等作用遞送siRNA至全身主要組織。研究了MTC納

10、米粒的巨噬細(xì)胞攝取，結(jié)果表明:MTC納米粒促進(jìn)巨噬細(xì)胞對(duì)siRNA的攝取及胞質(zhì)釋放，細(xì)胞攝取機(jī)制主要涉及小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞和巨胞飲，與網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞無關(guān)，可避免被溶酶體捕獲。研究了載siRNA MTC納米粒的巨噬細(xì)胞基因沉默效果，結(jié)果表明:MTC納米粒體外可高效介導(dǎo)Raw264.7細(xì)胞和小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞的RNAi效應(yīng)。LPS/D-GalN誘導(dǎo)急性肝損傷C57BL/6小鼠口服載siRNA MTC納米粒后，血清TNF-α、谷丙轉(zhuǎn)氨酶

11、(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)含量和組織巨噬細(xì)胞TNF-α mRNA表達(dá)均顯著降低，肝臟切片觀察表明小鼠肝臟損傷得到顯著緩解，小鼠存活率顯著提高。與腹腔注射給藥相比，C57BL/6小鼠口服MTC納米粒后可將siRNA高效遞送至血液和全身主要組織，體內(nèi)基因沉默效率亦顯著提高。LPS/D-GalN誘導(dǎo)急性肝損傷SD大鼠口服載siRNA MTC納米粒后，血清TNF-α和組織巨噬細(xì)胞TNF-α mRNA表達(dá)均顯著降低，肝臟切片觀察表明大鼠肝臟

12、損傷得到顯著緩解。C57BL/6小鼠口服MTC200NPs毒性試驗(yàn)結(jié)果表明MTC200 NPs安全性良好。
　　4基于MTC的siRNA口服高效納米給藥系統(tǒng)用于潰瘍性結(jié)腸炎的治療及機(jī)制
　　調(diào)節(jié)MTC200與TPP的質(zhì)量比，離子交聯(lián)法制備粒徑分別為150、1000nm和Zeta電勢為30 mV的MTC200 NPs和MTC200 LNPs，包載TNF-α siRNA。研究了MTC200 NPs和MTC200 LNPs的結(jié)構(gòu)穩(wěn)

13、定性、siRNA體外釋放、巨噬細(xì)胞攝取和基因沉默、Caco-2細(xì)胞單層轉(zhuǎn)運(yùn)，結(jié)果表明:二種納米粒生理環(huán)境結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，體外siRNA釋放、Raw264.7細(xì)胞攝取和Raw264.7細(xì)胞體外基因沉默效率均無顯著差異;但MTC200 LNPs的Caco-2細(xì)胞單層轉(zhuǎn)運(yùn)和攝取量顯著低于MTC200 NPs。健康C57BL/6小鼠口服載siRNA MTC200 LNPs后血液和主要組織中siRNA的含量顯著低于MTC200 NPs;潰瘍性結(jié)腸炎C5

14、7BL/6小鼠口服載siRNA MTC200 LNPs后可避免被小腸正常上皮組織吸收而特異性聚集在炎癥部位并促進(jìn)巨噬細(xì)胞的攝取，故與MTC200 NPs相比，MTC200 LNPs在結(jié)腸局部炎癥部位的siRNA分布百分比顯著提高。研究了潰瘍性結(jié)腸炎小鼠口服載siRNAMTC200 LNPs和MTC200 NPs的體內(nèi)RNAi功效，結(jié)果表明:小鼠結(jié)腸組織TNF-α含量、TNF-α、IL-1β、IL-6和IFN-γmRNA的相對(duì)表達(dá)和MPO

15、含量均顯著降低，顯著緩解小鼠體重下降和結(jié)腸組織局部炎癥，MTC200 LNPs的治療效果優(yōu)于MTC200 NPs。C57BL/6小鼠口服MTC200 NPs毒性試驗(yàn)表明MTC200LNPs安全性良好。
　　5 MTC納米粒的siRNA結(jié)合-釋放與體內(nèi)外轉(zhuǎn)染效率的關(guān)系
　　選用三聚磷酸鈉(TPP)、透明質(zhì)酸(HA，Mw100 kDa)和丙烯酸樹脂Ⅲ號(hào)(Eudragit S100，ES)為離子交聯(lián)劑，與MTC聚合物經(jīng)離子交聯(lián)法制

16、備7種納米粒，包載TNF-α siRNA，通過改變離子交聯(lián)劑種類和比例調(diào)節(jié)siRNA的釋放速度;制得MTC納米粒粒徑為120-225 nm、Zeta電勢為18-37 mV，多分散系數(shù)(P.I.)均小于0.3，粒徑分布均勻;MTC納米粒的包封率均高于98％。MTC納米粒結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，可有效保護(hù)siRNA在小鼠體液中免遭核酶降解。最低肝素鈉解離濃度試驗(yàn)和體外釋放試驗(yàn)結(jié)果表明，MTC納米粒對(duì)siRNA的結(jié)合能力隨離子交聯(lián)劑種類的增多、離子交聯(lián)劑中

17、HA和ES比例的升高而增大，siRNA的釋放速率和累積釋放量與之相反。MTC納米粒細(xì)胞黏附、細(xì)胞攝取量和細(xì)胞攝取速度均無顯著性差異。研究了MTC納米粒介導(dǎo)體外Raw264.7基因沉默效果，結(jié)果表明:緩慢釋放siRNA的MTC納米粒高效介導(dǎo)長時(shí)程基因沉默，可用于口服給藥有效治療C57BL/6小鼠慢性局部炎癥-潰瘍性結(jié)腸炎;快速釋放siRNA的MTC納米粒高效介導(dǎo)短時(shí)程基因沉默，可用于口服給藥有效治療C57BL/6小鼠急性全身性炎癥-急性肝