負載siRNA的適配子修飾脂質(zhì)-聚合物復合納米粒的肺腫瘤靶向給藥系統(tǒng)研究.pdf

1、目的：制備適配子修飾脂質(zhì)-聚合物復合納米粒的肺腫瘤靶向給藥系統(tǒng)，研究對survivin siRNA的負載與傳遞能力，并對其安全性和有效性進行體內(nèi)外評價。
　　方法：利用開環(huán)反應合成荷正電的類脂質(zhì)材料環(huán)氧烷胺衍生物（EAAD，Epoxy Alkyl Amine Derivative），并通過1H-NMR和FTIR進行表征。用納米沉淀法制備負載siRNA的適配子修飾脂質(zhì)-聚合物復合納米粒（AS1411-LHNPs），測定其粒徑、Zet

2、a電位、siRNA的抗血清降解能力與體外釋放等。采用噴霧冷凍干燥法制備AS1411-LHNPs的干粉吸入劑，并進行制劑學評價。其次，利用MTT法、流式細胞儀（FCM）和激光共聚焦顯微鏡（CLSM）考察載體的細胞毒性及其對細胞攝取、胞內(nèi)分布、細胞周期與凋亡的影響。通過目標基因及蛋白表達水平，考察survivin siRNA-AS1411-LHNPs對靶基因的沉默效果。以順鉑（DDP）為模型藥物，考察survivin siRNA-AS141

3、1-LHNPs對DDP的A549細胞抑制作用的影響。然后，利用Luciferase轉染的人源性肺腺癌細胞株（Luc-A549）建立裸鼠原位肺癌模型，小動物活體成像儀考察尾靜脈注射與肺部吸入給藥對Cy5-siRNA-AS1411-LHNPs的裸鼠體內(nèi)分布影響。最后，通過小動物成像和CT考察survivin siRNA-AS1411-LHNPs與DDP聯(lián)和應用對腫瘤的抑制效果，并利用H&E染色研究裸鼠各器官組織的變化。
　　結果：1H

4、-NMR和FT-IR驗證了EAAD的結構，其純度約為93％。AS1411-LHNPs的粒徑為（73.0±3.8）nm，且外形圓整、粒徑均一，Zeta電位為（-5.9±0.6）mV，且能有效提高siRNA在血清中的穩(wěn)定性，并在pH7.4的PBS介質(zhì)中緩慢釋放。噴霧冷凍干燥法制得LHNPs的干粉吸入劑，其空氣動力學粒徑為2.8μm左右，排空率大于90%，略有引濕性，能夠滿足肺部給藥系統(tǒng)的要求。MTT結果顯示，LHNPs安全性良好。細胞攝取與

5、胞內(nèi)定位實驗結果表明，AS1411-LHNPs在A549細胞的攝取高達92%，且主要定位于細胞質(zhì)中。AS1411-LHNPs在A549-RAW264.7共培養(yǎng)體系中可避開RAW264.7的攝取，有選擇性的被A549細胞攝取。RT-PCR和Western Blot結果顯示，survivin siRNA-S1411-LHNPs顯著下調(diào)靶基因mRNA與蛋白的表達，且與Lipofectamine2000相比具有長效作用。細胞周期和細胞凋亡實驗結

6、果表明，與對照組相比，survivin siRNA-AS1411-LHNPs可顯著延長A549細胞的G2期并促進其凋亡。聯(lián)合使用survivin siRNA-AS1411-LHNPs和DDP，可顯著降低順鉑對A549細胞的 IC50值，提高 A549細胞對順鉑的敏感性，且存在一定的協(xié)同作用。Cy5-siRNA-AS1411-LHNPs經(jīng)肺部吸入后，能提高肺部的局部藥物濃度，并延長藥物滯留時間。體內(nèi)抑瘤實驗和 H&E染色結果表明，聯(lián)合使用