含羧基小分子藥物介導(dǎo)親水聚合物自組裝構(gòu)建納米給藥系統(tǒng)研究.pdf

1、現(xiàn)代新藥研發(fā)中,大量候選藥物由于其低水溶性、低生物利用度或毒性較大等問(wèn)題而難以走向臨床應(yīng)用。另一方面,目前臨床治療使用的大量小分子藥物,由于疏水性導(dǎo)致的溶解度問(wèn)題和較低的口服生物利用度也大大限制了其更有效而廣泛的臨床應(yīng)用。新型藥物遞送系統(tǒng)為解決此類提供了有效手段,其中納米釋藥系統(tǒng)因其微小的粒徑和特殊結(jié)構(gòu)而具備一系列獨(dú)特優(yōu)勢(shì),是目前先進(jìn)藥物遞送系統(tǒng)研究的前沿和熱點(diǎn)。廣泛的研究表明,納米釋藥系統(tǒng)可以顯著增加難溶性藥物的溶解度,同時(shí)大大提高許

2、多藥物的口服生物利用度。此外,通過(guò)被動(dòng)及主動(dòng)靶向方式,納米遞送系統(tǒng)可顯著提高藥物療效,降低藥物毒副作用和不良反應(yīng)。聚合物自組裝體是納米遞送系統(tǒng)中最為廣泛研究的微粒系統(tǒng)之一,該類納米微粒系統(tǒng)被廣泛用于包括小分子藥物、多肽、蛋白和核酸等在內(nèi)的各種藥物的遞送研究中。聚合物自組裝體一般是指親水或兩親性聚合物通過(guò)非共價(jià)鍵作用(包括疏水、靜電、氫鍵等)介導(dǎo)的自組裝形成的聚合物微粒系統(tǒng)。疏水性藥物一般通過(guò)疏水作用物理包裹于聚合物納米組裝體的疏水微區(qū)中

3、。然而,單一的疏水作用往往導(dǎo)致最終納米組裝體中藥物負(fù)載量很低,而提高投藥量又會(huì)導(dǎo)致藥物形成結(jié)晶。盡管可以通過(guò)提高劑量的方式達(dá)到治療目的,但這同時(shí)大大增加了聚合物載體材料的用量,使得一方面治療成本增加,另一方面過(guò)多聚合物材料的使用會(huì)直接導(dǎo)致毒副作用。此外,制備聚合物自組裝體使用的共聚物,其化學(xué)結(jié)構(gòu)往往較為復(fù)雜,合成過(guò)程繁瑣,不宜進(jìn)行準(zhǔn)確的結(jié)構(gòu)表征,且大規(guī)模合成批次重復(fù)性差,因此也是限制聚合物自組裝體納米釋藥系統(tǒng)臨床應(yīng)用的關(guān)鍵因素之一。

4、r>　　綜上所述,構(gòu)建安全有效的、藥物負(fù)載性能好、制備簡(jiǎn)便、且易于規(guī)模化制備的聚合物自組裝體具有十分重要的意義。本課題創(chuàng)新性地提出通過(guò)聚合物和藥物間的多重非共價(jià)鍵作用構(gòu)建聚合物納米組裝體的設(shè)想。為了驗(yàn)證該假設(shè),本研究首先選擇商品化的聚乙烯亞胺(PEI)均聚物為模型載體材料,選用非甾體類抗炎藥吲哚美辛(IND)為模型藥物,開(kāi)展了多重非共價(jià)鍵作用構(gòu)建聚合物自組裝體納米釋藥系統(tǒng)的研究。由于PEI同時(shí)含有伯胺、仲胺和叔胺基團(tuán),IND含有羧基和疏

5、水單元,PEI與IND之間同時(shí)存在靜電、氫鍵及疏水相互作用。在深入研究PEI與IND之間不同作用方式,并詳細(xì)表征所得納米組裝體理化特性的基礎(chǔ)上,選擇結(jié)構(gòu)不同的模型藥物分子證明了該策略的普適性。通過(guò)口服給藥開(kāi)展了大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究,并通過(guò)急性和慢性炎癥模型進(jìn)行了體內(nèi)藥效學(xué)評(píng)價(jià)工作。為探究基于PEI/藥物組裝體作為口服釋藥系統(tǒng)的潛在應(yīng)用,對(duì)分子量為800和25000的PEI進(jìn)行了口服急性毒性評(píng)價(jià)。在此基礎(chǔ)上,為了進(jìn)一步提高載體材料PEI的生

6、物相容性,在本課題的第二部分研究中,我們?cè)O(shè)計(jì)、合成了β-環(huán)糊精鍵合聚乙烯亞胺(PEI-CD)。β-環(huán)糊精的引入一方面可起到降低載體材料毒性作用的目的;另一方面,也賦予了材料與藥物之間額外的非共價(jià)鍵作用,即環(huán)糊精空腔與疏水基團(tuán)之間的主-客體相互作用,更有利于納米粒自組裝體的形成。為了實(shí)現(xiàn)口服后病灶部位的靶向,在成功構(gòu)建PEI/IND聚合物納米組裝體的基礎(chǔ)上,我們采用酵母細(xì)胞壁作為微囊包被PEI/IND納米微粒。通過(guò)酵母細(xì)胞壁中β-1,3葡

7、聚糖與巨噬細(xì)胞表面β-葡聚糖受體之間的識(shí)別作用來(lái)靶向巨噬細(xì)胞,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥部位靶向。同樣,對(duì)于酵母細(xì)胞壁包裹PEI/IND納米組裝體系統(tǒng),我們開(kāi)展了體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)和藥效學(xué)研究。
　　方法：
　　1.含羧基小分子藥物的PEI或PEI-CD納米組裝體微粒的制備
　　通過(guò)透析法來(lái)制備PEI和不同小分子羧基藥物的納米組裝體,具體方法如下:首先將一定比例的藥物和PEI溶于一定體積的親水性有機(jī)溶劑中,得到的溶液于室溫下透

8、析去除有機(jī)溶劑記得制備得到納米組裝體水溶液?；赑EI-CD的納米組裝體采用改良的透析法來(lái)制備,制備時(shí),將溶于水溶性有機(jī)溶劑中的藥物溶液在超聲作用下加入一定濃度的PEI-CD水溶液中,得到的混合體系在水溶液中透析即可得到載藥組裝體溶液。其中涉及的含羧基的小分子藥物包括吲哚美辛、布洛芬、萘普生、二氟尼柳和氟比洛芬等。
　　2.酵母細(xì)胞壁包裹納米組裝體系統(tǒng)的制備
　　首先通過(guò)酸堿處理出去酵母內(nèi)容物得到酵母細(xì)胞壁(YS)。包裹PE

9、I/IND納米組裝體時(shí),稱取一定量的酵母細(xì)胞,加入PEI水溶液超聲搖勻后,于37℃孵育使YS完全溶脹,再加入含有IND的DMSO溶液,搖勻后孵育一定時(shí)間,離心洗滌除去DMSO和未包裹PEI/IND,凍干即可得到酵母細(xì)胞載藥微囊(DL-YS)。
　　3.釋藥系統(tǒng)的理化性能表征
　　其中載藥量與包封率采用紫外法(UV)測(cè)定。通過(guò)掃描電子顯微鏡(SEM)、透射電子顯微鏡(TEM)及原子力顯微鏡(AFM)來(lái)觀察組裝體形貌。動(dòng)態(tài)光散射

10、法(DLS)測(cè)定載藥組裝體微粒形態(tài)、大小及分布;表面電位儀測(cè)定表面電位。
　　4.載藥組裝體中藥物存在形式的表征
　　通過(guò)差示掃描量熱儀(DSC)和X-射線衍射儀(XRD)以及激光共聚焦顯微鏡(CLSM)表征載藥組裝體中藥物的存在形式和分布行為。
　　5.藥物-聚合物間多重相互作用的表征
　　聚合物的結(jié)構(gòu)通過(guò)核磁共振光譜(1HNMR)來(lái)確定。藥物、聚合物、藥物聚合物物理混合物及載藥組裝體分別進(jìn)行紅外光譜(FT-I

11、R)和核磁共振光譜(NMR)測(cè)定,以分析其多重相互作用力的存在。
　　6.β-環(huán)糊精鍵合聚乙烯亞胺(PEI-CD)的合成
　　通過(guò)對(duì)甲苯磺酰氯單取代β-環(huán)糊精與聚乙烯亞胺之間的親核取代反應(yīng)制備β-環(huán)糊精鍵合聚乙烯亞胺(PEI-CD)。
　　7.體外釋放及模擬胃腸道研究
　　對(duì)含有IND的納米組裝體進(jìn)行了體內(nèi)釋放動(dòng)力學(xué)研究,具體方法如下。取含有一定量藥物的載藥組裝體水溶液進(jìn)行體外釋放實(shí)驗(yàn),同時(shí)選擇原料藥、片劑為對(duì)照

12、樣品。分別在pH7.4的PBS緩沖液和模擬胃腸道環(huán)境的不同釋放液中進(jìn)行釋放實(shí)驗(yàn)。藥物釋放量通過(guò)UV法測(cè)定,計(jì)算累計(jì)釋放百分率,并繪制藥物累積釋放曲線。
　　8.大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究
　　SD大鼠口服灌胃給藥后,預(yù)定時(shí)間點(diǎn)采集血樣,離心后取一定量血漿,通過(guò)乙腈沉淀蛋白,內(nèi)標(biāo)法測(cè)定IND濃度,繪制藥時(shí)曲線,DAS軟件計(jì)算主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。
　　9.載藥組裝體在腸道內(nèi)保留時(shí)間及其對(duì)胃腸道刺激研究
　　使用熒光標(biāo)記聚合物

13、制備IND載藥組裝體,SD大鼠灌胃給藥后,預(yù)定時(shí)間點(diǎn)將其處死立即取胃腸道組織,進(jìn)行病理切片。HE染色后顯微鏡下觀察胃腸道刺激情況,熒光顯微鏡下觀察載藥組裝體在腸道內(nèi)的滯留情況。
　　10.量子點(diǎn)/酵母細(xì)胞壁(QD-YS)的制備
　　通過(guò)表面帶有正電荷的量子點(diǎn)(QD)的自發(fā)沉積來(lái)制備載有量子點(diǎn)的酵母細(xì)胞微囊。即,取一定量酵母空微囊,加入一定體積量子點(diǎn)在37℃下孵育一段時(shí)間,通過(guò)離心洗滌除去未包裹量子點(diǎn)。
　　11.活體成

14、像觀察
　　使用裸鼠來(lái)建立關(guān)節(jié)炎模型,口服一定量QD-YS,24h后取主要臟器和右后爪進(jìn)行活體成像觀察,并對(duì)各臟器和足趾部位熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量,以此研究酵母微囊系統(tǒng)的關(guān)節(jié)炎靶向作用。
　　12.藥效學(xué)評(píng)價(jià)方法
　　通過(guò)角叉菜膠誘導(dǎo)的急性足趾腫脹模型和弗氏佐劑誘導(dǎo)的慢性關(guān)節(jié)炎模型來(lái)評(píng)價(jià)本研究所構(gòu)建的不同釋藥系統(tǒng)的療效,以預(yù)防和治療兩種方式給藥進(jìn)行研究;實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取胃、腸道不同部位和腫脹足趾組織,進(jìn)行病理切片,HE染色。

15、r>　　13.口服急性毒性評(píng)價(jià)
　　選擇昆明小鼠,通過(guò)灌胃給予不同劑量的PEI,對(duì)照組給予生理鹽水,連續(xù)觀察14天。觀察的指標(biāo)包括一般指標(biāo)(如動(dòng)物外觀、行為、對(duì)刺激的反應(yīng)、分泌物、排泄物等),動(dòng)物死亡情況(死亡時(shí)間、瀕死前反應(yīng)等),動(dòng)物體重變化(每?jī)商旆Q重一次)等;記錄所有的死亡情況、出現(xiàn)的癥狀,以及癥狀起始的時(shí)間、嚴(yán)重程度、持續(xù)時(shí)間等。對(duì)所有動(dòng)物進(jìn)行大體解剖,觀察器官變化情況,對(duì)任何器官出現(xiàn)體積、顏色、質(zhì)地的改變,均記錄并進(jìn)行組

16、織病理學(xué)檢查。
　　結(jié)果：
　　1.通過(guò)簡(jiǎn)便的透析法可以成功制備IND與PEI的納米組裝體,其形態(tài)為球形,粒徑大小在幾十納米至幾百納米之間,表面帶正電荷;其中藥物負(fù)載量高達(dá)80％。采用不同含羧基藥物進(jìn)行的研究表明該自組裝方法具有普適性。
　　2.基于FT-IR和NMR的研究表明,PEI與羧基小分子藥物間存在多重非共價(jià)鍵相互作用,包括氫鍵、靜電作用和疏水作用;通過(guò)DSC和XRD測(cè)定和CLSM觀察表明,藥物與聚合物組裝體中

17、藥物以無(wú)定形態(tài)存在,藥物均勻分散于組裝體中。
　　3.體外藥物釋放研究表明,PEI/IND納米組裝體明顯加快藥物的溶出和釋放,且其釋放具有pH響應(yīng)特性,在胃部幾乎不釋放,而主要在腸道釋放;體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,通過(guò)制備成PEI/IND納米組裝體能夠有效提高藥物的口服生物利用度;基于急性足趾腫脹模型和慢性炎癥模型進(jìn)行的體內(nèi)藥效學(xué)研究表明,納米組裝體釋藥系統(tǒng)大大提高了藥物的治療效果,同時(shí)并不會(huì)導(dǎo)致明顯的毒副作用或不良反應(yīng)。
　

18、　4.口服急性毒性評(píng)價(jià)表明,PEI口服半致死劑量在2.5g/kg以上;臟器指數(shù)計(jì)算、血常規(guī)與肝腎功測(cè)定表明,在2.5g/kg以下口服PEI不會(huì)產(chǎn)生明顯的毒副作用。
　　5.在PEI中引入β-環(huán)糊精后得到的PEI-CD,其與羧基藥物組裝形成納米微粒的性能不會(huì)改變,PEI-CD/羧基藥物組裝體同樣具有高藥物負(fù)載量,并能加快藥物溶出,提高藥物口服生物利用度和體內(nèi)治療效果;急性毒性評(píng)價(jià)表明β-環(huán)糊精的引入能明顯降低PEI的口服毒性。

19、>　　6.通過(guò)靜電作用,酵母空微囊可以成功包裹PEI-IND納米組裝體,由此得到酵母載藥微囊,載藥量最高達(dá)到30%,而包封率可達(dá)70%;通過(guò)Zeta電位、TEM和CLSM觀察證明PEI/IND被成功包被于酵母細(xì)胞壁內(nèi)。
　　7.大鼠灌胃給藥后進(jìn)行的藥動(dòng)學(xué)研究表明,載藥酵母微囊INDYS能大大提高藥物的口服生物利用度,且INDYS較IND/PEI略有提高;同樣,基于角叉菜膠誘導(dǎo)的急性炎癥模型及弗氏佐劑誘導(dǎo)的慢性關(guān)節(jié)炎模型研究亦表明I