CTGF活化MAPK信號(hào)通路調(diào)控增生性瘢痕成纖維細(xì)胞生物學(xué)功能的研究.pdf

1、目的:
　　 研究結(jié)締組織生長因子(Connective tissue growth factor,CTGF)對增生性瘢痕成纖維細(xì)胞(Hypertrophic scar fibroblast,HSF)生物學(xué)功能的影響,探討CTGF獨(dú)立致組織纖維化的作用機(jī)理,并初步確定絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)各亞家族作為其下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化效應(yīng),為增生性瘢痕發(fā)病機(jī)制研究及

2、防治措施提供新的思路
　　 方法:
　　 1、分離培養(yǎng)人HSF,以正常人皮膚成纖維細(xì)胞(Normal skin fibroblast,NSF)作為對照,采用不同濃度CTGF作用細(xì)胞,或以同一濃度CTGF作用細(xì)胞不同時(shí)間后,MTT法檢測細(xì)胞增殖,H3-脯氨酸摻入法檢測細(xì)胞膠原合成率,RT-PCR檢測細(xì)胞Ⅰ型前膠原、CTGFmRNA的表達(dá)。
　　 2、應(yīng)用Western-Blot蛋白免疫印跡法檢測CTGF刺激細(xì)胞后不

3、同時(shí)相點(diǎn)MAPK途徑亞家族ERK1/2、P38、JNK磷酸化蛋白表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化情況,篩選CTGF作用于HSF活化的下游MAPK信號(hào)分子。
　　 3、預(yù)先用ERK1/2特異性抑制劑PD98059及P38特異性抑制劑SB203580阻斷細(xì)胞信號(hào),再加入CTGF刺激,MTT法及H3-胸腺嘧啶摻入法(H3-TdR)檢測細(xì)胞增殖;H3-脯氨酸摻入法檢測細(xì)胞膠原合成;RT-PCR檢測細(xì)胞Ⅰ型前膠原、CTGF mRNA、α-SMA mRNA的

4、表達(dá);流式細(xì)胞術(shù)檢測α-SMA陽性細(xì)胞率;Western-Blot技術(shù)檢測α-SMA蛋白表達(dá)變化,確定CTGF活化MAPK亞家族P38、ERK1/2的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及對細(xì)胞生物學(xué)功能的影響過程。
　　 結(jié)果:
　　 1、MTT檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),HSF在CTGF的獨(dú)立刺激作用下增殖明顯,在一定濃度范圍(5ng/ml～20ng/ml)及時(shí)間(0～48h)呈明顯的濃度依賴性和時(shí)間依賴性:CTGF對HSF的促增殖作用強(qiáng)于NSF。

5、>　　 2、H3-脯氨酸摻入法檢測細(xì)胞膠原合成變化,發(fā)現(xiàn)小劑量CTGF(5ng/ml)即能顯著增加HSF的膠原合成,且隨CTGF濃度的升高及作用時(shí)間的延長而增強(qiáng):CTGF也能增加NSF膠原合成水平,但增加幅度較低。RT-PCR法檢測HSF與NSF細(xì)胞Ⅰ型前膠原mRNA表達(dá)變化趨勢的結(jié)果類似。
　　 3、RT-PCR法檢測在外源性CTGF刺激下HSF細(xì)胞內(nèi)CTGF mRNA的表達(dá)變化,發(fā)現(xiàn)在50ng/ml CTGF的刺激作用下,

6、HSF中CTGF mRNA于刺激開始后8h表達(dá)顯著升高,且一直保持升高趨勢,于48h后表達(dá)水平達(dá)到峰值并至少維持至72h,與空白對照組比有顯著性差異(P＜0.05);NSF中CTGF mRNA的表達(dá)在外源性CTGF刺激作用下也有小幅度增高。
　　 4、Western-Blot法檢測CTGF作用后HSF中MAPK信號(hào)的活化情況,發(fā)現(xiàn)磷酸化ERK1/2的表達(dá)自刺激作用開始后10min即顯著升高,30min時(shí)活化達(dá)到最高峰,此后逐漸下

7、降,240min時(shí)恢復(fù)至刺激前水平;磷酸化P38表達(dá)自CTGF作用后30min增高,120min時(shí)達(dá)到最高峰,此后逐漸下降,240min時(shí)恢復(fù)至刺激前水平;磷酸化JNK表達(dá)水平在CTGF刺激作用下240min內(nèi)均無顯著變化。
　　 5、采用PD98059特異性阻斷HSF中ERK1/2信號(hào)通路,再用CTGF進(jìn)行刺激,結(jié)果提示,與未用PD98059阻斷組相比,細(xì)胞增殖率及DNA合成率均顯著受抑,但仍高于無CTGF刺激組(P＜0.05

8、);α-SMA的mRNA及蛋白表達(dá)與α-SMA陽性細(xì)胞率、膠原合成及CTGF mRNA表達(dá)等在阻斷前后無顯著性變化。
　　 6、采用SB203580特異性阻斷HSF中P38信號(hào)通路,再加入CTGF進(jìn)行刺激,結(jié)果顯示α-SMA mRNA及蛋白表達(dá)、α-SMA陽性細(xì)胞率等細(xì)胞轉(zhuǎn)分化指標(biāo)與未阻斷組相比顯著受抑,但仍高于無CTGF刺激組(P＜0.05);細(xì)胞增殖及DNA合成、膠原合成率、Ⅰ型前膠原mRNA、CTGF mRNA的表達(dá)均未受

9、到抑制。
　　 結(jié)論:
　　 1、CTGF能獨(dú)立有效地促進(jìn)HSF增殖、轉(zhuǎn)分化及膠原合成,其促增殖作用具有顯著的濃度依賴性和時(shí)間依賴性。
　　 2、CTGF具有對HSF細(xì)胞促進(jìn)自身CTGF mRNA自分泌表達(dá)的效應(yīng)。
　　 3、CTGF主要通過激活MAPK通路中ERK.1/2及P38亞家族信號(hào)途徑發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng),其中對ERK1/2信號(hào)途徑的活化部分介導(dǎo)CTGF刺激HSF細(xì)胞增殖效應(yīng);對P38信號(hào)途徑的活化部