USP4介導(dǎo)的TGFβ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖的影響.pdf

1、背景：
　　瘢痕是人體創(chuàng)面修復(fù)過程的一種自然產(chǎn)物，其中病理性瘢痕則是皮膚損傷后創(chuàng)面過度修復(fù)引起以大量ECM合成及沉積為特征的皮膚纖維化疾病。它主要包括增生性瘢痕和瘢痕疙瘩，其中增生性瘢痕(hypertrophic scar，HS)在臨床中非常多見，其表現(xiàn)為突出皮膚表面或呈持續(xù)生長(zhǎng)的亢奮狀態(tài)。大量研究表明，TGF-β是促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)及瘢痕形成的關(guān)鍵效應(yīng)因子，TGF-β的生物活性的發(fā)揮主要通過Smads家族介導(dǎo)的。而TGF-β/Smad

2、信號(hào)通路主要通過活化的TGF-β與其胞膜TβRII（TGFβ-receptor II）相結(jié)合，促使TβRI（TGFβ-receptor I）與TβRII形成受體異聚體，隨后 TβRI的GS區(qū)磷酸化，激活TβRI，與Smad2和Smad3形成TβRI-SARA-Smads復(fù)合體，隨后將Smad2和Smad3磷酸化，與Smad4形成異源復(fù)合物轉(zhuǎn)入細(xì)胞核，最終調(diào)控成纖維細(xì)胞的增值、分化及膠原代謝，促進(jìn)增生性瘢痕形成。由此可見TβRI是TGF-

3、β/Smad信號(hào)通路的關(guān)鍵組分。不僅如此，抑制型蛋白Smad7是TGF-β/Smad信號(hào)通路的主要負(fù)性調(diào)節(jié)因子，Smad7通過負(fù)反饋調(diào)節(jié)著正性與負(fù)性Smads之間的平衡。近年來(lái)研究表明，泛素特異性蛋白酶4（USP4）可增強(qiáng)TGF-β信號(hào)通路的水平，但在HS形成中，USP4對(duì)TGF-β信號(hào)通路的作用還未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)就從組織水平及細(xì)胞水平研究USP4對(duì)瘢痕形成的調(diào)控作用，為瘢痕的防治探索新方法。
　　目的：
　　探討USP4在

4、HS形成中的重要作用，尤其是TGF-β/Smad信號(hào)通路的調(diào)控作用；通過泛素特異性蛋白酶抑制劑（Vialinin A）抑制USP4表達(dá)，明確USP4與TβRI、Smad7的相關(guān)性，闡明USP4對(duì)增生性瘢痕的作用機(jī)制，為臨床上利用USP4作為藥物作用靶點(diǎn)治療HS提供重要的理論依據(jù)。
　　方法：
　　1、取本院整形外科臨床上增生性瘢痕患者的HS標(biāo)本以及瘢痕周圍正常皮膚組織標(biāo)本15例（傷后6個(gè)月~1年內(nèi)），低溫下迅速帶回實(shí)驗(yàn)室處理

5、；部分組織生理鹽水洗凈后用4％中性甲醛固定后，常規(guī)脫水和石蠟包埋，進(jìn)行免疫組化檢測(cè)；部分組織用于Western blot檢測(cè)人增生性瘢痕組織中USP4及TβRI蛋白表達(dá)水平差異，并以正常皮膚組織(Normal tissue，NS)作為對(duì)照。
　　2、收集人增生性瘢痕組織及瘢痕周圍正常皮膚標(biāo)本，采用改良組織塊聯(lián)合胰酶消化法體外培養(yǎng)人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞（Hypertrophic scar fibroblast，HSFB）和正常皮膚成

6、纖維細(xì)胞（Normal skin fibroblast，NSFB）。①取第4代FB（Fibroblast），Western blot檢測(cè)HSFB與NSFB中USP4、TβRI和Smad7蛋白表達(dá)水平；②人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞鋪板培養(yǎng)24h后加入5μmol/LVialinin A（USP4抑制劑），在0h、12h、24 h、48h后收取細(xì)胞，運(yùn)用Western blot再次檢測(cè)USP4、TβRI及Smad7蛋白的表達(dá)水平；③人增生性瘢痕成

7、纖維細(xì)胞以每孔1×104/ml密度接種于96孔板培養(yǎng)24h后加入5μmol/L Vialinin A，MTT法檢測(cè)Vialinin A對(duì)HSFB增殖的影響，并以未干預(yù)的細(xì)胞作為對(duì)照。
　　結(jié)果：
　　1、免疫組化結(jié)果顯示：USP4在NS中表皮基底細(xì)胞中有少量陽(yáng)性表達(dá)，F(xiàn)B中未見明顯陽(yáng)性表達(dá)，在HS中除了表皮基底細(xì)胞外，F(xiàn)B胞膜及胞漿中存在大量的陽(yáng)性表達(dá)，兩者比較具有差異(P＜0.01)；TβRI在NS中FB中基本不著色，在H

8、S中FB胞膜及胞漿可見大量陽(yáng)性表達(dá)，兩者比較具有顯著差異(P＜0.01)。
　　2、Western Blot結(jié)果顯示：USP4及TβRI在HS高表達(dá)，USP4及TβRI在NS表達(dá)水平較低，兩者比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性(P＜0.05)；USP4及TβRI在HSFB中的蛋白表達(dá)較NSFB的高（(P＜0.05)，而Smad7蛋白在HSFB中低表達(dá)(P＜0.05)；加入Vialinin A后，隨著時(shí)間推移，USP4及TβRI蛋白在HSFB中

9、的表達(dá)水平逐漸降低，在作用12h后明顯降低（P<0.05），Smad7蛋白的表達(dá)則逐漸升高（P<0.05），進(jìn)一步證實(shí)USP4與TβRI正相關(guān)，與Smad7負(fù)相關(guān)。
　　3、MTT結(jié)果顯示：加入Vialinin A后的HSFB與未被干預(yù)的HSFB相比，增殖活性降低(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1、增生性瘢痕組織及細(xì)胞中USP4及TβRI蛋白明顯增高，Smad7在增生性瘢痕成纖維細(xì)胞低表達(dá)。
　　2、下調(diào)人增