新分子ITIP表達(dá)、特性鑒定與抗腫瘤免疫效果及機(jī)制研究.pdf

1、腫瘤是一類(lèi)嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的疾病,近年的研究表明:通過(guò)合理的綜合治療,可以提高惡性腫瘤的治療效果。腫瘤生物治療作為繼傳統(tǒng)的手術(shù)、放療和化療之后的第四種治療模式在腫瘤的綜合治療中發(fā)揮愈來(lái)愈重要的作用。在腫瘤患者重建有效的免疫應(yīng)答及抑制腫瘤的血管形成,是腫瘤治療的兩個(gè)重要策略。趨化因子不僅可引導(dǎo)淋巴細(xì)胞定向遷移,同時(shí)又能抑制血管形成,阻斷腫瘤的血液供應(yīng),因此是腫瘤生物治療的理想選擇。
　　已有的研究表明,CXC亞家族趨化因子IFN誘導(dǎo)

2、的T細(xì)胞α趨化因子(ITAC)和IFN-γ誘導(dǎo)蛋白10(IP10)既具有募集表達(dá)CXC趨化因子受體3(CXCR3)淋巴細(xì)胞的功能,誘導(dǎo)Th1型免疫應(yīng)答,又能夠抑制血管生成。功能分析表明,ITAC是CXCR3最強(qiáng)的激動(dòng)劑;IP10具有較ITAC更顯著的抗血管作用。結(jié)構(gòu)分析表明,趨化因子的N端和N-LOOP區(qū)是結(jié)合及活化受體的關(guān)鍵部位,主要通過(guò)C端結(jié)合在血管內(nèi)皮細(xì)胞表面發(fā)揮抗血管生成的作用。我們實(shí)驗(yàn)室的前期工作根據(jù)小鼠ITAC和IP10基因

3、序列設(shè)計(jì)構(gòu)建了一個(gè)新的分子,由ITAC的N端、N-LOOP區(qū)與IP10的C端融合而成,命名為ITIP。計(jì)算機(jī)模擬結(jié)果表明:新分子ITIP能形成穩(wěn)定的趨化因子樣三維空間構(gòu)象。我們期望ITIP功能上具有類(lèi)似趨化因子的特性,更重要的是保留ITAC和IP10各自的功能優(yōu)勢(shì),從而發(fā)揮更顯著的抗腫瘤作用。
　　為驗(yàn)證我們的設(shè)想是否成立,本研究表達(dá)純化得到ITIP蛋白,通過(guò)體外功能實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其活性;在不同的腫瘤模型,觀察ITIP抗腫瘤效果;最后探

4、討ITIP的抗腫瘤機(jī)制。
　　第一部分新分子:ITIP的原核表達(dá)、純化及其特異性抗體制備
　　為了大量制備有活性的ITIP蛋白,我們采用原核系統(tǒng)表達(dá)融合蛋白的策略:在目的基因的N端融合硫氧還蛋白標(biāo)記、6組氨酸標(biāo)記以及編碼腸激酶特異識(shí)別多肽的堿基序列。硫氧還蛋白的融合表達(dá),有助于提高表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性;6組氨酸標(biāo)記有利于后續(xù)融合蛋白的純化;腸激酶的識(shí)別位點(diǎn)便于酶切去除N端標(biāo)簽蛋白得到ITIP目的蛋白。
　　我們首先以實(shí)驗(yàn)室

5、前期構(gòu)建的pcDNA3-ITIP載體為模板PCR擴(kuò)增得到編碼ITIP成熟肽的基因片段,插入原核表達(dá)載體pET32a(+)構(gòu)建pET32a-ITIP的重組質(zhì)粒。將構(gòu)建成功的pET32a-ITIP轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)經(jīng)異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo),結(jié)果在分子量27 Kda可見(jiàn)明顯的條帶,與預(yù)期的融合蛋白分子量大小一致(標(biāo)簽蛋白約19 Kda,ITIP目的蛋白約8.7 Kda),提示成功誘導(dǎo)表達(dá)ITIP融合蛋白。

6、r>　　經(jīng)蛋白表達(dá)條件優(yōu)化,最后確定0.1mM IPTG 37℃誘導(dǎo)4h為最適條件。SDS聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)分析蛋白分布,結(jié)果融合蛋白在上清和包涵體均有表達(dá),主要以可溶性形式表達(dá)。融合蛋白以鎳離子親和層析法純化,SDS-PAGE鑒定純度＞90％。低溫冷凍干燥濃縮融合蛋白后經(jīng)二辛可寧酸(BCA)法蛋白定量,以重組腸激酶(rEK)酶切去除N端融合的標(biāo)簽蛋白,再過(guò)鎳離子親和層析柱,收集穿透液得到ITIP蛋白。目的蛋白的Tr

7、icine-SDS-PAGE分析結(jié)果顯示,分子量8.7 Kda處可見(jiàn)明顯條帶,與ITIP蛋白預(yù)期分子量大小一致,純度＞90％。以ITAC的N端抗體、IP10的C端抗體分別進(jìn)行Western blot鑒定ITIP蛋白,均可見(jiàn)單一條帶。以ITIP蛋白作為免疫原免疫新西蘭白兔,免疫后血清經(jīng)飽和硫酸銨沉淀、QAE-Sephadex A50離子交換層析純化得到ITIP多克隆抗體(pAb)。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)測(cè)定效價(jià)為1:100 000

8、,Western blot鑒定得到單一條帶。
　　同時(shí)為后續(xù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)照蛋白的需要,我們也構(gòu)建了pET32a-ITAC及pET32a-IP10重組質(zhì)粒,以相同條件誘導(dǎo)表達(dá)、純化相應(yīng)蛋白,經(jīng)Tricine-SDS-PAGE和Western blot鑒定,制備得到ITAC和IP10蛋白。
　　第二部分ITIP的體外功能特性鑒定
　　為確定構(gòu)建表達(dá)的新分子ITIP是否具有趨化因子樣的功能特性,更重要的是檢測(cè)是否具有我們所期望

9、的ITAC更為優(yōu)勢(shì)的激動(dòng)受體CXCR3的能力,及IP10更好的抗血管作用。我們分別應(yīng)用趨化、受體內(nèi)化、鈣離子內(nèi)流實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ITIP是否保留了與ITAC類(lèi)似的活性,應(yīng)用血管內(nèi)皮細(xì)胞的劃痕修復(fù)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)誘導(dǎo)的小鼠腹壁Matrigel種植體實(shí)驗(yàn)鑒定ITIP是否具有與IP10相當(dāng)?shù)囊种蒲苄纬傻奶匦浴?br>　　鑒于ITAC和IP10均為CXCR3的配體,而ITIP由ITAC和IP10的結(jié)構(gòu)域組成,我們推測(cè)ITIP也通過(guò)

10、CXCR3受體發(fā)揮作用。已有的研究表明,CXCR3主要高表達(dá)在活化的T淋巴細(xì)胞表面,我們首先以熒光激活細(xì)胞分類(lèi)術(shù)(FACS)確定Con A與IL-2刺激活化的淋巴細(xì)胞CXCR3的表達(dá),然后應(yīng)用此細(xì)胞檢測(cè)ITIP的趨化活性。結(jié)果顯示:1、10、100、1000ng/ml ITIP對(duì)活化的淋巴細(xì)胞均有不同程度的趨化作用,其中以100ng/ml趨化活性最強(qiáng)。以CXCR3阻斷抗體與活化淋巴細(xì)胞孵育后,再以100ng/ml ITIP進(jìn)行趨化實(shí)驗(yàn),

11、結(jié)果趨化活性明顯受到抑制,提示ITIp對(duì)于CXCR3+淋巴細(xì)胞具有趨化活性。以市售的ITAC、IP10蛋白為對(duì)照,比較ITIP的趨化能力,結(jié)果表明濃度10、100、1000ng/ml ITIP的趨化活性與ITAC相當(dāng),較IP10顯著,也優(yōu)于ITAC與IP10聯(lián)合使用(P＜0.05),提示新分子基本保留了ITAC的N端和N-LOOP區(qū)的功能特性。
　　為進(jìn)一步證實(shí)ITIP的活性,我們構(gòu)建了pcDNA3.1-mCXCR3重組質(zhì)粒,電轉(zhuǎn)

12、CHO細(xì)胞,經(jīng)G418篩選,RT-PCR、FACS鑒定穩(wěn)定高表達(dá)mCXCR3的細(xì)胞株。然后分別應(yīng)用活化的淋巴細(xì)胞、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染mCXCR3的CHO(CHO/mCXCR3)細(xì)胞進(jìn)行CXCR3受體內(nèi)化實(shí)驗(yàn)。結(jié)果與趨化實(shí)驗(yàn)一致:ITIP與ITAC活性類(lèi)似,在100ng/ml使細(xì)胞表面CXCR3表達(dá)降低55-65％,IP10使其降低30-35％,ITAC與IP10聯(lián)合使用降低35-40％。最后分別應(yīng)用活化的淋巴細(xì)胞和CHO/mCXCR3細(xì)胞進(jìn)行鈣離

13、子內(nèi)流實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)ITIP的活性:ITIP可引起短暫而迅速的鈣離子內(nèi)流,ITIP、ITAC激發(fā)的平均熒光強(qiáng)度(MFI)高于IPIO、ITAC與IP10聯(lián)合使用所檢測(cè)到的MFI。通過(guò)上述幾種不同的檢測(cè)方法,我們均得到一致的結(jié)果,提示ITIP保留了ITAC的N端和N-LOOP區(qū)所具有的功能優(yōu)勢(shì),具有與ITAC類(lèi)似的更強(qiáng)的激動(dòng)受體CXCR3的活性,優(yōu)于IP10單獨(dú)或與ITAC合用的效果。
　　血管內(nèi)皮細(xì)胞劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:ITIP

14、對(duì)bFGF誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移的抑制作用與IP10相當(dāng),遷移入劃痕區(qū)的細(xì)胞數(shù),較ITAC處理組明顯減少(P＜0.01),與ITAC和IP10簡(jiǎn)單混合組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05),提示ITIP保留了IP10的功能特性。為進(jìn)一步確證ITIP抑制血管的活性,我們采用檢測(cè)體內(nèi)血管生成的常用方法Matrigel種植體技術(shù),觀察ITIP對(duì)bFGF誘導(dǎo)的小鼠體內(nèi)血管生成的抑制效果。
　　結(jié)果顯示:ITIP處理組與IP10處理組類(lèi)似,與I

15、TAC處理組、ITAC與IP10聯(lián)合處理組比較,遷移入Matrigel種植體內(nèi)的血管內(nèi)皮細(xì)胞的數(shù)量減少,形成的血管管腔的數(shù)目降低,結(jié)果均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05),提示ITIP保留了IP10更有效的抑制血管形成的作用。
　　總結(jié)以上結(jié)果:本研究構(gòu)建表達(dá)的新分子ITIP是有生物活性的,更重要的是具有我們預(yù)期得到的ITAC和IP10各自的功能優(yōu)勢(shì),可用于下一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究。
　　第三部分ITIP在不同腫瘤模型中抗腫瘤效果研究

16、
　　本部分工作,旨在通過(guò)建立不同的腫瘤模型,觀察融合了ITAC和IP10功能優(yōu)勢(shì)的新分子ITIP是否可發(fā)揮更顯著的抗腫瘤的作用,有效抑制腫瘤的生長(zhǎng)乃至促進(jìn)腫瘤消退。
　　我們分別建立BALB/c小鼠CT26結(jié)腸癌、4T1乳腺癌和C57BL/6小鼠3LL肺癌三種腫瘤模型,應(yīng)用ITIP蛋白腫瘤局部注射,同時(shí)以PBS、ITAC、IP10、ITAC聯(lián)合IP10蛋白治療組為對(duì)照。ITAC與IP10蛋白為第一部分制備得到的蛋白,經(jīng)趨化

17、實(shí)驗(yàn)、bFGF誘導(dǎo)的小鼠腹壁Matrigel種植體實(shí)驗(yàn)鑒定與市售ITAC、IP10蛋白具有相近的活性。三種腫瘤模型的治療結(jié)果顯示:ITIP蛋白可抑制腫瘤生長(zhǎng),較。PBS對(duì)照組統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著(P＜0.001)。應(yīng)用ITAC、IP10蛋白治療,可以延緩腫瘤的生長(zhǎng),一定程度上延長(zhǎng)小鼠的生存期,結(jié)果與已有報(bào)道一致。應(yīng)用ITIP蛋白治療,與單獨(dú)應(yīng)用ITAC、IP10蛋白或是聯(lián)合應(yīng)用兩種蛋白治療比較,能夠更為有效的抑制腫瘤生長(zhǎng)、延長(zhǎng)小鼠生存期,結(jié)果

18、均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。尤其在CT26結(jié)腸癌、4T1乳腺癌模型,具有明顯的抗腫瘤效果,ITIP治療組小鼠腫瘤完全消退,小鼠生存期明顯延長(zhǎng),90天依然100％存活。
　　同時(shí)我們觀察了ITIP蛋白可能對(duì)小鼠潛在的副作用,重要器官心、肝、脾、肺、腎的蘇木素-伊紅(H&E)染色結(jié)果顯示:各組織未見(jiàn)異常的形態(tài)學(xué)變化。ELISA檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)收集的小鼠血清未檢測(cè)到抗ITIP的抗體。
　　第四部分ITIP抗腫瘤機(jī)制探討
　

19、　我們以CT26結(jié)腸癌模型為研究基礎(chǔ),分別檢測(cè)各組治療后24h脾臟淋巴細(xì)胞亞群的比例變化、腫瘤局部的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)、荷瘤小鼠細(xì)胞免疫應(yīng)答水平及腫瘤局部的血管形成,初步探討ITIP可能的抗腫瘤機(jī)制。
　　首先基于已有的報(bào)道:應(yīng)用趨化因子進(jìn)行腫瘤局部治療,不僅可以抑制治療側(cè)腫瘤的生長(zhǎng),同時(shí)也可一定程度延緩遠(yuǎn)側(cè)未治療腫瘤的生長(zhǎng)。對(duì)ITIP也進(jìn)行了同樣的檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)ITIP治療具有這樣的作用?？紤]ITIP局部治療可能激發(fā)了全身性的免疫應(yīng)答

20、,我們應(yīng)用FACS檢測(cè)各治療組脾臟淋巴細(xì)胞比例的變化。
　　結(jié)果顯示:ITIP治療組CXCR3+淋巴細(xì)胞比例與ITAC治療組比較無(wú)明顯差異,但較其它各組均有增加(P＜0.05)。對(duì)表達(dá)CXCR3的主要淋巴細(xì)胞亞群進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)其中CD3+T細(xì)胞增加最為顯著:Mψ、NK、DC細(xì)胞的比例變化各蛋白治療組之間比較無(wú)明顯差異。進(jìn)一步檢測(cè)結(jié)果顯示:ITIP治療組CD4+和CD8+的淋巴細(xì)胞比例,與PBS、IP10、ITAC聯(lián)合IP10蛋白治

21、療組比較均有上調(diào)(P＜0.05)。腫瘤組織的H&E染色結(jié)果顯示:ITIP與ITAC治療組,可見(jiàn)大面積的壞死,大量的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn);其他蛋白治療組只有散在的壞死灶和部分淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。腫瘤組織的免疫熒光染色結(jié)果顯示:CXCR3+淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)明顯,其中CD3+T細(xì)胞為主,CD4+、CD8+的淋巴細(xì)胞均有不同程度浸潤(rùn),CD8+淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)更為明顯。腫瘤組織的CD31免疫熒光染色結(jié)果可見(jiàn):ITIP與IP10治療組腫瘤的血管密度明顯降低,與其它各蛋白

22、治療組相比,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。荷瘤小鼠細(xì)胞免疫應(yīng)答檢測(cè)結(jié)果:ITIP治療組脾臟淋巴細(xì)胞以腫瘤特異性抗原刺激后,體外增殖能力與ITAC組相當(dāng),較IP10、ITAC聯(lián)合IP10治療組增強(qiáng);對(duì)CT26靶細(xì)胞的特異性殺傷活性增強(qiáng),與IP10、ITAC聯(lián)合IP10治療組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),提示ITIP增強(qiáng)了機(jī)體細(xì)胞免疫應(yīng)答水平。
　　綜上所述,基于ITAC和IP10的功能優(yōu)勢(shì),通過(guò)理論預(yù)測(cè)而構(gòu)建的新分子ITIP,不