Lymphopenia Setting對(duì)腫瘤疫苗免疫效果的影響及機(jī)制研究.pdf

1、本研究以化療肺癌患者以及化療小鼠動(dòng)物模型為切入點(diǎn),通過(guò)觀察化療后體內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量、不同免疫細(xì)胞亞群的比例變化,驗(yàn)證是否存在“淋巴細(xì)胞減少及后續(xù)細(xì)胞活化增殖(lymphopenia setting)”現(xiàn)象；在此基礎(chǔ)上,以腫瘤疫苗免疫,通過(guò)體內(nèi)免疫保護(hù)和體外功能檢測(cè)實(shí)驗(yàn),觀察在淋巴細(xì)胞減少狀態(tài)下是否能誘生免疫正應(yīng)答以及對(duì)免疫效果的影響；更進(jìn)一步,對(duì)其可能作用機(jī)制進(jìn)行探討,并對(duì)其潛在的臨床應(yīng)用前景提供理論基礎(chǔ)。
　　 1.肺癌化療患者

2、和化療小鼠存在lymphopenia setting現(xiàn)象
　　 淋巴細(xì)胞減少癥(lymphopenia)是指機(jī)體外周淋巴細(xì)胞絕對(duì)總數(shù)的減少,具體表現(xiàn)在:成人淋巴細(xì)胞總數(shù)<1000/μl,兒童(2歲以下)<3000/μl。淋巴細(xì)胞減少可以由遺傳和非遺傳因素導(dǎo)致,后者為臨床常見(jiàn),如淋巴細(xì)胞減少癥在感染性疾病主要是以CD4+T細(xì)胞減少的艾滋病為代表；在腫瘤則多見(jiàn)于放、化療后引起的淋巴細(xì)胞減少。淋巴細(xì)胞減少后,機(jī)體為了維持自身免疫穩(wěn)定,

3、發(fā)生免疫自穩(wěn)性增生,初始T細(xì)胞活躍地分裂增殖,最后達(dá)到淋巴細(xì)胞減少前的正常水平,這個(gè)過(guò)程稱(chēng)為“淋巴細(xì)胞減少驅(qū)動(dòng)的細(xì)胞增殖”(Lymphopenia-dnven proliferation,LDP),我們將淋巴細(xì)胞數(shù)目從減少到回復(fù)的整個(gè)時(shí)期定義為“l(fā)ymphopenia setting”。為了觀察肺癌患者化療后是否存在lymphopenia setting及相應(yīng)的免疫學(xué)特性變化,我們對(duì)23人次的肺癌患者化療后外周血免疫細(xì)胞數(shù)量及各淋巴細(xì)胞

4、亞群比例進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明,肺癌患者化療后的白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)量均呈現(xiàn)先下降后回復(fù)的過(guò)程,歷時(shí)10天左右,其中在第4-6天,淋巴細(xì)胞數(shù)量下降至最低點(diǎn),均小于1000/μl,表明化療患者存在lymphopenia setting現(xiàn)象。同時(shí),我們以流式細(xì)胞術(shù)對(duì)CD8+、CD4+、CD4+CD25-以及CD4+CD25+T細(xì)胞亞群比例進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn):隨著淋巴細(xì)胞數(shù)日發(fā)生改變,CD8+T細(xì)胞的比例檢測(cè)顯示沒(méi)有明顯變化,而CD4

5、+T細(xì)胞的比例隨之發(fā)生改變,表現(xiàn)為先降低后回復(fù)的過(guò)程,與淋巴細(xì)胞數(shù)量的改變相一致；進(jìn)一步,CD4+T細(xì)胞中的CD4+CD25-T細(xì)胞比例沒(méi)有發(fā)生明顯變化,而CD4+CD25+T細(xì)胞比例呈現(xiàn)降低后回復(fù)的趨勢(shì),提示在CD4+T細(xì)胞的比例改變中,主要是以CD4+CD25+T細(xì)胞的比例改變?yōu)橹?。綜合上述結(jié)果:腫瘤化療患者經(jīng)歷了淋巴細(xì)胞數(shù)鼉減少,且CD4+T和CD4+CD25+T淋巴細(xì)胞亞群比例在lymphopenia setting狀態(tài)下發(fā)生顯

6、著性改變。
　　 為模擬臨床,我們用化療藥物在C57BL/6小鼠體內(nèi)建立了淋巴細(xì)胞減少癥動(dòng)物模型。參照臨床使用劑量,通過(guò)體表面積換算,以150mg/kg單次腹腔注射環(huán)磷酰胺(CTX),結(jié)果顯示:注射后第1天,外周血、脾臟和淋巴結(jié)中的淋巴細(xì)胞數(shù)顯著下降,第4天下降至最低谷,僅為正常數(shù)量的10％左右,隨后淋巴細(xì)胞數(shù)量緩慢上升,至第7-10天恢復(fù)至正常水平,呈現(xiàn)典型的lymphopeniasetting現(xiàn)象。FACS分析各淋巴細(xì)胞亞群

7、的比例也與臨床結(jié)果一致,即CD4+T和CD4+CD25+T細(xì)胞亞群比例隨著淋巴細(xì)胞數(shù)量的改變而發(fā)生相應(yīng)的變化,而CD4+CD25-和CD8+T細(xì)胞亞群比例則基本保持不變。為說(shuō)明這些結(jié)果并不是環(huán)磷酰胺特定藥物的特定作用,我們以另一臨床常見(jiàn)的肺癌化療藥物-泰素帝(Taxotere)40mg/kg單次處理C57BL/6小鼠,獲得了與環(huán)磷酰胺處理相同的結(jié)果。表明:1)化療藥物處理后呈現(xiàn)的lymphopenia setting并非某一特定藥物的特

8、定作用,是化療藥物作用后的普遍現(xiàn)象；2)成功地建立了能反映臨床化療后淋巴細(xì)胞減少癥的化療小鼠動(dòng)物模型,為開(kāi)展后續(xù)的lyrnphopenia setting狀態(tài)下的免疫應(yīng)答研究奠定基礎(chǔ)。
　　 2、Lymphopenia setting對(duì)腫瘤疫苗誘導(dǎo)抗腫瘤免疫的影響
　　 Lymphopenia setting現(xiàn)象反映出機(jī)體具有淋巴細(xì)胞自穩(wěn)性增生的潛能,為證實(shí)這種潛能是否對(duì)外界抗原刺激產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答,我們以小鼠Lewi

9、s肺癌細(xì)胞株3LL的CTL表位MUT-1荷載于DC表面制成腫瘤疫苗,在化療小鼠淋巴細(xì)胞數(shù)量減少的最低點(diǎn)(第4天)主動(dòng)免疫,于免疫后7天用3LL腫瘤細(xì)胞攻擊,從體內(nèi)、體外觀察小鼠腫瘤生長(zhǎng)及生存、免疫應(yīng)答的特異性增殖、殺傷及細(xì)胞因子分泌等功能。結(jié)果顯示,化療小鼠經(jīng)腫瘤疫苗免疫后,誘生了有效的免疫應(yīng)答,致敏淋巴細(xì)胞不僅對(duì)MUT-1特異性抗原肽的體外刺激具有增殖反應(yīng),而且對(duì)母本3LL細(xì)胞的刺激亦具有顯著的增殖效應(yīng)；反應(yīng)上清中細(xì)胞因子IFNγ的分

10、泌水平和體外特異性殺傷功能也呈現(xiàn)相同結(jié)果,提示腫瘤疫苗免疫化療小鼠能誘生有效的免疫正應(yīng)答。更令人興奮的結(jié)果是,與未經(jīng)歷lymphopeniasetting的正常小鼠腫瘤疫苗免疫效果相比較,化療小鼠誘生了增強(qiáng)的淋巴細(xì)胞特異性增殖、殺傷和細(xì)胞因子分泌功能(P<0.05),顯著抑制了腫瘤的體內(nèi)生長(zhǎng)(P<0.05),所有化療小鼠經(jīng)歷主動(dòng)免疫后對(duì)腫瘤細(xì)胞的攻擊具有抵抗作用,未見(jiàn)腫瘤生長(zhǎng),并長(zhǎng)期存活(P<0.05)。為排除該保護(hù)性效應(yīng)可能由于化療藥

11、物的直接作用引起,我們?cè)O(shè)立了單純使用化療藥物的對(duì)照組,結(jié)果發(fā)現(xiàn)體內(nèi)、外均未能誘生免疫應(yīng)答及保護(hù)效應(yīng)；其次,為排除化療藥物對(duì)腫瘤疫苗的間接修飾作用,以化療藥物作用后第4天(淋巴細(xì)胞數(shù)量減少的最低點(diǎn))的小鼠血清體外與DC-MUT1腫瘤疫苗孵育,隨后主動(dòng)免疫正常小鼠,觀察腫瘤生長(zhǎng),結(jié)果發(fā)現(xiàn):與未進(jìn)行血清處理的DC-MUT1腫瘤疫苗結(jié)果相似,血清處理腫瘤疫苗不具有完全保護(hù)效應(yīng)。提示DC-MUT1腫瘤疫苗在化療小鼠體內(nèi)誘生的免疫應(yīng)答以及增強(qiáng)的免疫

12、效果主要與淋巴細(xì)胞減少及后續(xù)的免疫細(xì)胞在外來(lái)抗原刺激下的活躍增殖相關(guān)。
　　 進(jìn)一步,為更好地模擬臨床腫瘤患者化療誘生lymphopenia setting的免疫功能改變,我們首先以3LL腫瘤細(xì)胞接種C57BL/小鼠,造成荷瘤狀態(tài),再按常規(guī)給予化療藥物泰素帝(Taxotere),隨后給予3LL-GM(3LL轉(zhuǎn)染GM-CSF)腫瘤疫苗,體內(nèi)觀察其生存情況,體外檢測(cè)小鼠的免疫功能。結(jié)果發(fā)現(xiàn):荷瘤小鼠在化療誘生的lymphopenia

13、 setting下應(yīng)用腫瘤疫苗免疫,獲得了明顯優(yōu)于未經(jīng)歷lymphopenia setting小鼠的免疫應(yīng)答,70％的荷瘤小鼠在化療和腫瘤疫苗的作用下成功地使腫瘤消退,其余30％荷瘤小鼠的腫瘤生長(zhǎng)速度明顯減緩,而僅應(yīng)用腫瘤疫苗或化療的小鼠均不能使荷瘤小鼠的腫瘤消退以及延長(zhǎng)小鼠的生存時(shí)間,二者相比較具有顯著性差異(P<0.05)。進(jìn)一步,對(duì)存活小鼠以3LL母本腫痛細(xì)胞再攻擊,所有小鼠均無(wú)腫瘤發(fā)生,提示存活小鼠獲得了特異性免疫記憶功能。體外

14、通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子IFNγ的表達(dá)同樣證實(shí)3LL-GM腫瘤疫苗在化療小鼠體內(nèi)誘生了特異性的細(xì)胞免疫應(yīng)答。說(shuō)明荷瘤小鼠在淋巴細(xì)胞減少狀態(tài)下進(jìn)行腫瘤疫苗的主動(dòng)免疫可以獲得有效的抗腫瘤免疫應(yīng)答,最終使腫瘤消退,并維持小鼠長(zhǎng)期存活。
　　 3、Lymphopenia setting增強(qiáng)抗腫瘤效應(yīng)的可能機(jī)制研究
　　 在這部分研究?jī)?nèi)容中,我們對(duì)lymphopenia setting誘生增強(qiáng)的腫瘤免疫應(yīng)答機(jī)制進(jìn)行了探討,我們發(fā)現(xiàn),

15、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在其中發(fā)揮關(guān)鍵的作用。首先,通過(guò)比較未進(jìn)行化療的32例腫瘤患者與23例化療腫瘤患者外周血中的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例,我們發(fā)現(xiàn),未進(jìn)行化療的臨床手術(shù)病人外周血及腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞中CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例顯著高于正常對(duì)照(P<0.05),表明腫瘤患者的Treg比例是升高的。而腫瘤化療患者,化療后的CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例呈現(xiàn)顯著下降,但是,CD4+CD25+T、CD8+T細(xì)胞亞群的比例不

16、變,說(shuō)明lymphopenia setting可以選擇性地下調(diào)Treg亞群比例,從而減少對(duì)CD8+T細(xì)胞效應(yīng)功能發(fā)揮的抑制。其次,在動(dòng)物模型中,根據(jù)化療后小鼠體內(nèi)Treg的動(dòng)態(tài)變化,我們分別在化療后第1、4、7天給予腫瘤疫苗免疫,隨后進(jìn)行腫瘤細(xì)胞攻擊。結(jié)果顯示:在調(diào)節(jié)性T細(xì)胞亞群比例最低點(diǎn)(第4天)給予腫瘤疫苗,誘導(dǎo)出最佳的免疫應(yīng)答,所有小鼠均獲得完全的保護(hù)效應(yīng),并長(zhǎng)期存活:而在Treg亞群比例較高的第1和7天給予腫瘤疫苗,沒(méi)有獲得免疫

17、保護(hù)效應(yīng),提示Treg亞群比例的升高與未誘導(dǎo)出有效的免疫保護(hù)效應(yīng)之間存在相關(guān)性,表明Treg參與了淋巴細(xì)胞減少癥下的免疫負(fù)調(diào)控。最后,在荷瘤小鼠的lymphopenia setting狀態(tài)下進(jìn)行腫瘤疫苗免疫的實(shí)驗(yàn)中,我們以抗CD8+T細(xì)胞亞群的單克隆抗體注射化療小鼠,清除體內(nèi)的CD8+T細(xì)胞亞群,結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有小鼠的腫瘤呈進(jìn)行性快速生長(zhǎng),提示CD8+T細(xì)胞亞群介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答在抗腫瘤免疫應(yīng)答中的重要性。然而,當(dāng)我們以抗CD4+T細(xì)胞亞群